地表水中的藥物成分殘留正在逐漸成為備受關注的環境問題。為了適應自然資源保護措施的不斷發展，需要具備靈敏且快速的水質監測檢測方法。我們近期已經進行了拴系粒子運動（TPM）的平行化處理。TPM是一種在單分子水平上，測量DNA大分子構象變化的技術。本文利用高通量TPM(htTPM)檢測嵌入到DNA分子內的藥物。做為概念驗證，我們分析了兩種DNA嵌入染料YOYO-1和SYTOX橙的高通量信號。接著利用doxorubicin（阿霉素）證明了該方法對嵌入性藥物檢測的有效性。我們進一步評估了該技術檢測carbamazepine（卡馬西平）的可能性。卡馬西平是一種被廣泛使用的抗癲癇藥物，據報道，該藥物能夠通過內嵌作用與DNA相互作用。我們的結果表明，卡馬西平并不是DNA嵌合子。我們通過不同的緩沖液和溶液得到的結果，為我們提供了通過htTPM監測水溶液中DNA嵌合化合物的可優化條件。
如果藥物毫無疑問對公眾健康有益，那么人們對于其可能對環境造成的不良影響（這些影響源于其生物活性）的擔憂則日益加劇。水生環境與其尤其相關，因為其匯聚了人類藥物成分殘留的主要來源。在醫院或家中給藥后，大部份的藥物殘留，未經改變的藥物大分子或藥物代謝物，這些物質會被排出，并被輸送至城市污水處理廠（WWTPs)。通過普通的污水處理過程，藥物和它們的代謝物的清理并不徹底，這些物質在污水處理廠的排放口處進入地表水之中。
該類環境問題已經引起了全世界范圍的大規模的關注和研究，并已經開展了多項測量活動，以量化藥物在淡水系統以及污水處理廠排放物中的出現頻率和最終去向，并且有關藥物對水生環境的生態毒性影響的數據也在不斷積累。我們可以合理地預期，其中一些物質不久將會被列入制定質量標準和相關建議的優先物質清單之中。因此，在環境保護措施不斷演變的同時，我們應當開發出便攜式、易于使用且成本效益高的設備，以便能夠進行快速但靈敏的水質監測。的確，標準且最為強力的對藥物在環境水樣本中的殘留進行分析的方法是液相色譜-質譜聯用。雖然大量前瞻性的研究主要使用這種方法，但就時間、人力以及儀器設備的投入而言，其成本過高，因此無法用于現場監測。免疫檢測，具備較高的靈敏度，是一種潛在的替代法，但是其耗時且需要大量的人力。過去的十年，大量以納米技術為基礎的方法被廣泛報道，但迄今為止，僅有一些商業解決方案出現，這使得人們對于在速度和多功能性方面取得顯著進展的前景充滿了期待。所有這些技術都是為了實現特定的檢測目的而設計的，它們包含識別元件（抗體、適配體）、多種納米材料（金納米粒子、量子點、碳納米管、石墨烯等）、主要的光學檢測原理（熒光、表面等離子體共振、比色法）或電學原理（場效應晶體管、電化學）以及微流控技術。在本文中，由于其特定的自組裝特性，功能性和多樣性，DNA已經成為一種理想的傳感材料。用于環境檢測的核酸生物傳感器的數據輸出策略是利用DNA雜交狀態和/或DNA構象的改變，DNA酶的切割和DNA或RNA適配體與靶點結合情況。為了實現輸出的數字化，研究人員設計了基于單分子 DNA 的檢測方法，用于進行免疫夾心反應。該方法通過 DNA 繩索將顆粒附著在表面上，并利用流體作用通過視頻顯微鏡來計數和觀察這些附著的顆粒的運動。
在各種藥物之中，有幾種廣泛使用的藥物，通過嵌入DNA分子與DNA發生相互作用。由于其潛在的基因毒性和/或細胞毒性，該種類分子無疑對環境存在風險。能夠對它們在水中的存在進行系統的，有效的和快速的檢測，具有重要的意義。復合物嵌入DNA往往伴隨著DNA分子結構的改變以及嵌入部位堿基對之間距離的增加。一般來說，輪廓長度的延伸經發現最終伴隨著在持久長度上的修飾。拴系粒子運動檢測法（TPM），利用視頻顯微鏡以及成像分析，用以分析附著在表面的納米大小的粒子的運動幅度，是一個優異的檢測方法。我們最近通過將DNA-粒子復合物組裝在固定點陣上，成功地將這種單分子進行了并行處理，極大的提高了分辨率，精確度以及技術響應延遲。高通量TPM（htTPM)因此能夠檢測嵌合復合物。該技術促進了當前的研究，證明了htTPM具有檢測DNA內嵌藥物的能力。
為了初步驗證其有效性，我們對兩種做為熒光染料的DNA嵌入劑所產生的htTPM熒光信號進行了分析。我們選擇了廣泛使用的雙嵌入染料YOYO-1，其對DNA物理性質方面的影響已經單分子檢測法被廣泛研究。此外，為了與插入型藥物的情況相呼應，我們還選擇了另一種單插入劑型的青色染料——SYTOX 橙。隨后我們證明了htTPM在檢測摻入多柔比星自制合成水Oriv中的嵌入性藥物的潛能，該合成水中的粒子平均濃度最接近地表水中的粒子濃度組成。
多柔比星是一種治療癌癥的化療藥物，與DNA的主要互作模式是嵌合作用。最后，我們評估了該技術檢測卡馬西平的可能性，這是一種抗癲癇藥物，具有潛在的基因毒性和細胞效應，已被報道能夠通過嵌合與DNA發生相互作用。做為一種廣泛被使用的抗驚厥藥物和較高癲癇發病率，卡馬西平長期以來做為廢水處理效率的檢測指標，能夠在任何地表水中發現，因此值得引起關注。
平行化處理的TPM檢測法用于監測DNA內嵌相互作用
附著粒子運動技術是一種單分子法，通過對結合在DNA自由端的粒子的視頻成像監測DNA分子的有效長度（DNA的另一端固定在支持物表面）。為了實現該技術高通量的潛能，使它具有較高的分辨率，我們設計了一種單層DNA生物芯片，該芯片由一系列結合錨定點組成，芯片大小小于1um,可以在使它們保持一定距離互補干擾的情況下，平行檢測幾百個分子。
通過添加與DNA互作的嵌合分子，從而在堿基對之間插入了一個平面芳香基團，DNA 會經歷結構和力學上的變化。由嵌合引起的效應是堿基對之間距離的增加，可導致DNA分子的延伸，輪廓長度的增加。
這種伸長后引起的運動速率會隨著每個堿基對所含嵌合子的數量比例的增加而提高，并且已發現對于雙嵌合分子而言，其速率變化可高達約 50%。相比較裸露的DNA分子，根據對DNA雙螺旋受到的機械作用和嵌合子/DNA復合物電荷的改變，推測DNA的彎曲度也有可能受到影響。由于在彎曲度上有限的改變，我們希望TPM能夠通過直接測量粒子的運動幅度的增加而檢測嵌合分子的結合（請見Fig 1A）。TPM分析按照以下流程進行。在 1 分鐘的時間內，通過觀測區域獲取圖像，記錄頻率為每秒 25 幀（請見Fig 1B).一種專業軟件（Magellium, France)可實時追蹤所有粒子的位置并計算它們在時間軌跡上的運動幅度，記錄間隔為2秒。對于在不同濃度下分析的分子的解決方案，其最終的數據點是針對三個獨立生物芯片所確定的 ΔA 值的平均值（記為 <ΔA>）。<ΔA> 的誤差則取自這三個獨立結果之間的標準偏差（請見Fig 1C)。
DNA嵌合分子的高通量單分子檢測法示意圖
通過TPM檢測嵌合染料
我們首先通過分析兩種熒光染料，YOYO-1和SYTOX橙（這兩種染料通過單分子熒光顯微鏡廣泛用于DNA檢測），評估了TPM檢測DNA相互作用嵌合分子的能力。這兩種熒光染料都屬于氰菁染料家族，具有較高的DNA結合親和性和DNA結合后熒光強度可提高1000倍的特性。
我們測量了顆粒在1xTE緩沖液中的運動幅度，染料濃度范圍從nM到μM，發現顆粒的運動幅度隨YOYO-1和SYTOX橙濃度變化的差異（請見Fig 2)
htTPM檢測兩種DNA嵌合型熒光染料
合成水
我們首先測試htTPM技術與地表水的兼容性。對河水、泉水和自來水進行的測量顯示，A值的變化幅度均小于 5 納米。為了達到最理想的條件，例如地表水，在確保成分恒定且完全不含雜質的前提下，我們自制了一種合成水，用于驗證 TPM 檢測嵌入型藥物的能力。這種合成水被稱為“Oriv”（見表 1），其成分如下：
用于htTPM檢測的合成水成分表
TPM檢測溶液中的阿霉素
抗癌藥物阿霉素屬于蒽環類抗生素這一類別，屬于最早被發現并廣泛使用的癌癥化療藥物。多柔比星的細胞毒性來源于對拓撲異構酶II的抑制和接著發生的DNA相互作用。已知嵌合作用是與DNA相互作用的主要模式，是藥物發揮活性的主要原因。其相互作用的理化性質目前仍是理解多柔比星作用機制的主要方式。本文中，我們在三種條件下進行測試，1xTE緩沖液和1xPBS緩沖液可與相互作用的染料結果進行比較，合成水用于檢測該技術對地表水檢測的能力。與由插入作用所引起的 DNA 結構變化一致，在這三種基質中，隨著阿霉素濃度的增加，顆粒的運動幅度呈現出單調遞增的趨勢，直至達到飽和狀態（請見Fig 3)。
htTPM對溶液中藥物阿霉素的檢測結果
TPM檢測溶液中的藥物卡馬西平
卡馬西平是廣泛使用的抗驚厥藥物，屬于最常出現在地表水中的殘留化合物分之一，其出現頻率之高甚至被認為可以作為水生環境的人為污染標志物。盡管其已經證實具有慢性的基因毒性，但是其與DNA相互作用機制報道仍舊較少。如Fig 4A顯示，在合成水和 1X PBS中，隨著卡馬西平濃度從 0uM升至4uM，跨越40個濃度梯度，均未觀察到A值的變化。考慮到卡馬西平在水中較低的溶解度，我們利用HPLC測量了藥物的濃度。我們首先重復了已報道的所進行的吸光度測量，通過記錄在 1X PBS 緩沖液中加入逐漸提高濃度的含有ctDNA 的卡馬西平溶液的紫外-可見吸光度譜，并將緩沖液的吸光度譜作為參考（請見Fig 4B)。結果顯示，吸收光譜并未出現任何變化，尤其沒有出現因離子嵌入而產生的藍色位移特征。其次，我們采用了最新的 Switchsense 技術進行重復檢測，同樣并未觀測到卡馬西平與DNA相互作用的發生（請見Fig 4C).
三種技術對溶液中卡馬西平化合物的檢測結果
heliX+分子互作分析系統采用switchSENSE®技術，通過共價偶聯或標簽捕獲方式將感興趣的分子（配體）固定在heliX®芯片上,結合標準的自動化工作流程為分子互作提供高效解決方案。
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