在細胞生物學和藥物研發中，傳統研究流程需在微孔板、離心管、PCR板等多平臺間轉移樣本，導致實驗變異大（跨平臺誤差>20%）、核酸損失高（低細胞數樣本回收率<50%）。例如，基因表達分析需多次轉移樣本，單細胞核酸損失率高達70%。本篇文章中德國卡爾斯魯厄理工學院團隊開發的“Cells-to-cDNAonChip”技術，通過液滴微陣列（DMA）平臺與I.DOT非接觸式納升級分配技術的結合，首次實現從活細胞培養到cDNA合成的全流程納升級集成，將試劑消耗降低至傳統方法的1/100，操作時間縮短33%。該技術通過精準操控液滴微環境，同步實現表型分析與基因表達檢測，為單細胞研究和高通量篩選提供了革命性工具。
親水-超疏水圖案化表面：DMA玻片通過硅烷化處理和硫醇-炔點擊化學，形成1mm2親水斑點（接觸角<10°）與超疏水邊界（接觸角>150°），自發穩定納升液滴（圖1）。
圖1. “芯片上細胞至cDNA”方法的示意圖。1=在DMA上以微/納升液滴進行細胞培養和篩選，2=通過基于顯微鏡的方法進行細胞表型分析，3=使用聚T磁珠進行細胞裂解和mRNA分離，4=在同一液滴內將mRNA轉化為cDNA，5=收集cDNA用于定性和定量基因表達分析。
I.DOT 非接觸式分配技術：基于氣壓脈沖驅動（75-300 mbar?ms 可調），實現 200 nL 液滴的精準生成，體積誤差 <1%，單細胞接種成功率> 95%[36,45]。此外，通過動態調節壓力參數優化細胞存活，150mbar?ms壓力下，HeLa細胞存活率較75mbar?ms提升42%，避免接觸式移液的機械損傷[1]。
細胞培養與表型監測：通過I.DOT將1-1000個細胞/液滴接種至DMA親水斑點，在濕度腔（37°C, 5%CO?）中培養24-48小時。利用KeyenceBZ-9000顯微鏡實時捕獲熒光信號（如GFP表達強度），量化表型變化（文獻[1]）。
納升級分子操作：液滴內裂解與mRNA捕獲：I.DOT分配150nLRLT裂解緩沖液，結合poly-T磁珠（GEHealthcare）實現mRNA提取，洗脫效率達92%（傳統試管法75%）。同時，在200nL體系中加入SuperscriptIV逆轉錄酶，通過濕度腔的熱循環（65°C退火/52°C合成）完成cDNA合成，PCR擴增成功率100%[2,3]。
單細胞回收效率：單HeLa-GFP細胞的cDNA經qPCR檢測，Ct值波動僅±1.5cycle，回收率達85%±3%，較傳統試管法（50%±8%）提升70%[1]。
高通量一致性：672液滴同步處理不同濃度阿霉素，mRNA提取與cDNA合成的批次間變異系數<5%，IC??值與傳統384孔板吻合度>95%（圖2）。
圖2.在液滴微陣列上從總HeLa-CCL2RNA開始cDNA合成。A）DNA上cDNA合成的示意性方案。B、C）5μL和D、E）200nL液滴分別在3mm和1mmDMA親水點上的雙視野顯微鏡圖像，B、D）在cDNA合成反應之前，C、E）在cDNA合成反應之后。比例尺=500μm。F）用從50ngHeLa-CCL2總RNA合成的cDNA進行的GAPDHPCR（產物大小=112bp）的凝膠電泳圖像。[Lane編號1=1kbDNA梯狀條帶，2=無模板（陰性）對照，3=在微管中合成的cDNA的PCR產物（陽性對照），4=在3 mmDMA上合成的cDNA的PCR產物，體積為5 μL，5=在1 mmDMA上合成的cDNA的PCR產物，體積為200 nL]。G）用從50ngHeLa-CCL2總RNA合成的cDNA進行的ACTBPCR（產物大小=1045bp）的凝膠電泳圖像。凝膠泳道中的樣品序列與圖2F相同。
交叉污染控制：在 3 mm DMA 平臺的‘Cells-to-cDNA on Chip’流程中（圖 3），I.DOT非接觸式分配使跨液滴污染率<0.01%，顯著低于接觸式移液（1-5%）[3]。
圖3. 液滴微陣列上的“芯片上細胞到cDNA”方法的詳細示意性工作流程。RT =室溫。
siRNA干擾效率：液滴內轉染siGFP（100nM）48小時后，HeLa-GFP細胞熒光強度下降90%，qPCR顯示GFP轉錄水平降低至88.7%±2.3%，與表型數據高度吻合（圖4）。
圖4. 在3mmDMA上用“Cellsto-cDNAonChip”方法對不同細胞數和siRNA介導的靶基因敲除進行定性分析和基因表達定量。A、B）分別為GAPDH（產物大小=112bp）和ACTB（產物大小=1045bp）PCR的凝膠電泳圖像。[Lane編號1=1kbDNA梯狀條帶，2=無模板（陰性）對照，3=使用標準方案在微管中從HeLa-CCL2細胞合成的cDNA的PCR產物（陽性對照），4=在3mmDMA上從HeLa-CCL2細胞合成的cDNA的PCR產物，通過“芯片上細胞到cDNA”方法]。(C-D)分別在3mmDMA和PCR板上通過“Cells-to-cDNAonChip”方法從HeLa-CCL2細胞合成的cDNA的qPCR結果。C和D的條形圖表示10、100、500和1000個細胞的Ct值，每個重復5次。誤差條表示平均值土SEM。根據雙尾非配對t檢驗，*P<0.001，**P<0.01，計算為連續組之間的比較。NS=不顯著。在3mmDMA上siGFP轉染至HeLa-GFP細胞的評估：E-G）熒光顯微鏡圖像分別顯示未轉染、亂序siRNA轉染和siGFP轉染的細胞中的GFP表達（轉染48小時后）。比例尺=100μm。H）轉染48小時后HeLa-GFP細胞中的平均GFP熒光。數據表示為來自3個單獨實驗的平均值土SEM。根據雙尾非配對t檢驗，*P<0.001，**P<0.01。I）在3mmDMA上轉染48小時后細胞中GFP轉錄物水平的qPCR;通過“芯片上細胞至cDNA”方法合成cDNA。數據標準化為GAPDH表達，并表示為來自3個單獨實驗的平均值土SEM。*P<0.001，如通過雙尾非配對t檢驗計算的。
稀有細胞分析：從10個循環腫瘤細胞（CTCs）中成功提取mRNA，檢測到EGFRT790M突變，靈敏度較傳統方法提升10倍[1]。
無動物源培養：在無Matrigel的DMA表面，hiPSCs培養24小時存活率達70%-76%，Nanog蛋白表達量較傳統培養高1.8倍（P<0.05），證明微尺度環境可替代動物基質 [4]。
I.DOT通過納升級非接觸式分配，解決了傳統移液的交叉污染與機械損傷問題，單細胞接種誤差<5%，單日可處理超1000樣本，為稀有樣本（如臨床活檢細胞）的高效利用提供關鍵工具。從細胞到cDNA的閉環操作減少7次樣本轉移，使核酸損失降低60%，結合DMA的透明基底特性，實現“形態-基因”雙維度數據快速關聯[1,2]。
在應用場景與轉化潛力方面，液滴平臺在腫瘤藥敏篩選中可同步分析200種化合物對細胞凋亡（AnnexinV染色）和Bcl-2通路基因表達的影響，將周期從2周壓縮至3天；在單細胞醫學前沿，可用于胚胎干細胞（ESC）的多能性維持研究，通過I.DOT精準控制Wnt/β-catenin信號分子濃度，使Oct4陽性細胞比例提升至92%±2%[4]；在便攜化臨床檢測方面，結合便攜式熒光成像模塊，可在床邊對腫瘤穿刺樣本進行當場基因分型（如肺癌EGFR突變檢測），將報告時間從3天縮短至6小時。當前技術面臨的挑戰是需進一步優化液滴長期培養的營養補給（如動態微流控灌注），并開發AI算法實現“液滴圖像-基因數據”的自動化關聯分析，未來隨著I.DOT與光鑷、質譜等技術的融合，DMA平臺有望成為單細胞多組學（基因組+蛋白質組）研究的核心工具，推動精準醫療從“群體統計”邁向“單細胞解析”的新維度。
