地表水中的藥物成分殘留正在逐漸成為備受關(guān)注的環(huán)境問題。為了適應(yīng)自然資源保護(hù)措施的不斷發(fā)展，需要具備靈敏且快速的水質(zhì)監(jiān)測檢測方法。我們近期已經(jīng)進(jìn)行了拴系粒子運(yùn)動（TPM）的平行化處理。TPM是一種在單分子水平上，測量DNA大分子構(gòu)象變化的技術(shù)。本文利用高通量TPM(htTPM)檢測嵌入到DNA分子內(nèi)的藥物。做為概念驗(yàn)證，我們分析了兩種DNA嵌入染料YOYO-1和SYTOX橙的高通量信號。接著利用doxorubicin（阿霉素）證明了該方法對嵌入性藥物檢測的有效性。我們進(jìn)一步評估了該技術(shù)檢測carbamazepine（卡馬西平）的可能性。卡馬西平是一種被廣泛使用的抗癲癇藥物，據(jù)報道，該藥物能夠通過內(nèi)嵌作用與DNA相互作用。我們的結(jié)果表明，卡馬西平并不是DNA嵌合子。我們通過不同的緩沖液和溶液得到的結(jié)果，為我們提供了通過htTPM監(jiān)測水溶液中DNA嵌合化合物的可優(yōu)化條件。
如果藥物毫無疑問對公眾健康有益，那么人們對于其可能對環(huán)境造成的不良影響（這些影響源于其生物活性）的擔(dān)憂則日益加劇。水生環(huán)境與其尤其相關(guān)，因?yàn)槠鋮R聚了人類藥物成分殘留的主要來源。在醫(yī)院或家中給藥后，大部份的藥物殘留，未經(jīng)改變的藥物大分子或藥物代謝物，這些物質(zhì)會被排出，并被輸送至城市污水處理廠（WWTPs)。通過普通的污水處理過程，藥物和它們的代謝物的清理并不徹底，這些物質(zhì)在污水處理廠的排放口處進(jìn)入地表水之中。
該類環(huán)境問題已經(jīng)引起了全世界范圍的大規(guī)模的關(guān)注和研究，并已經(jīng)開展了多項(xiàng)測量活動，以量化藥物在淡水系統(tǒng)以及污水處理廠排放物中的出現(xiàn)頻率和最終去向，并且有關(guān)藥物對水生環(huán)境的生態(tài)毒性影響的數(shù)據(jù)也在不斷積累。我們可以合理地預(yù)期，其中一些物質(zhì)不久將會被列入制定質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)和相關(guān)建議的優(yōu)先物質(zhì)清單之中。因此，在環(huán)境保護(hù)措施不斷演變的同時，我們應(yīng)當(dāng)開發(fā)出便攜式、易于使用且成本效益高的設(shè)備，以便能夠進(jìn)行快速但靈敏的水質(zhì)監(jiān)測。的確，標(biāo)準(zhǔn)且最為強(qiáng)力的對藥物在環(huán)境水樣本中的殘留進(jìn)行分析的方法是液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用。雖然大量前瞻性的研究主要使用這種方法，但就時間、人力以及儀器設(shè)備的投入而言，其成本過高，因此無法用于現(xiàn)場監(jiān)測。免疫檢測，具備較高的靈敏度，是一種潛在的替代法，但是其耗時且需要大量的人力。過去的十年，大量以納米技術(shù)為基礎(chǔ)的方法被廣泛報道，但迄今為止，僅有一些商業(yè)解決方案出現(xiàn)，這使得人們對于在速度和多功能性方面取得顯著進(jìn)展的前景充滿了期待。所有這些技術(shù)都是為了實(shí)現(xiàn)特定的檢測目的而設(shè)計的，它們包含識別元件（抗體、適配體）、多種納米材料（金納米粒子、量子點(diǎn)、碳納米管、石墨烯等）、主要的光學(xué)檢測原理（熒光、表面等離子體共振、比色法）或電學(xué)原理（場效應(yīng)晶體管、電化學(xué)）以及微流控技術(shù)。在本文中，由于其特定的自組裝特性，功能性和多樣性，DNA已經(jīng)成為一種理想的傳感材料。用于環(huán)境檢測的核酸生物傳感器的數(shù)據(jù)輸出策略是利用DNA雜交狀態(tài)和/或DNA構(gòu)象的改變，DNA酶的切割和DNA或RNA適配體與靶點(diǎn)結(jié)合情況。為了實(shí)現(xiàn)輸出的數(shù)字化，研究人員設(shè)計了基于單分子 DNA 的檢測方法，用于進(jìn)行免疫夾心反應(yīng)。該方法通過 DNA 繩索將顆粒附著在表面上，并利用流體作用通過視頻顯微鏡來計數(shù)和觀察這些附著的顆粒的運(yùn)動。
在各種藥物之中，有幾種廣泛使用的藥物，通過嵌入DNA分子與DNA發(fā)生相互作用。由于其潛在的基因毒性和/或細(xì)胞毒性，該種類分子無疑對環(huán)境存在風(fēng)險。能夠?qū)λ鼈冊谒械拇嬖谶M(jìn)行系統(tǒng)的，有效的和快速的檢測，具有重要的意義。復(fù)合物嵌入DNA往往伴隨著DNA分子結(jié)構(gòu)的改變以及嵌入部位堿基對之間距離的增加。一般來說，輪廓長度的延伸經(jīng)發(fā)現(xiàn)最終伴隨著在持久長度上的修飾。拴系粒子運(yùn)動檢測法（TPM），利用視頻顯微鏡以及成像分析，用以分析附著在表面的納米大小的粒子的運(yùn)動幅度，是一個優(yōu)異的檢測方法。我們最近通過將DNA-粒子復(fù)合物組裝在固定點(diǎn)陣上，成功地將這種單分子進(jìn)行了并行處理，極大的提高了分辨率，精確度以及技術(shù)響應(yīng)延遲。高通量TPM（htTPM)因此能夠檢測嵌合復(fù)合物。該技術(shù)促進(jìn)了當(dāng)前的研究，證明了htTPM具有檢測DNA內(nèi)嵌藥物的能力。
為了初步驗(yàn)證其有效性，我們對兩種做為熒光染料的DNA嵌入劑所產(chǎn)生的htTPM熒光信號進(jìn)行了分析。我們選擇了廣泛使用的雙嵌入染料YOYO-1，其對DNA物理性質(zhì)方面的影響已經(jīng)單分子檢測法被廣泛研究。此外，為了與插入型藥物的情況相呼應(yīng)，我們還選擇了另一種單插入劑型的青色染料——SYTOX 橙。隨后我們證明了htTPM在檢測摻入多柔比星自制合成水Oriv中的嵌入性藥物的潛能，該合成水中的粒子平均濃度最接近地表水中的粒子濃度組成。
多柔比星是一種治療癌癥的化療藥物，與DNA的主要互作模式是嵌合作用。最后，我們評估了該技術(shù)檢測卡馬西平的可能性，這是一種抗癲癇藥物，具有潛在的基因毒性和細(xì)胞效應(yīng)，已被報道能夠通過嵌合與DNA發(fā)生相互作用。做為一種廣泛被使用的抗驚厥藥物和較高癲癇發(fā)病率，卡馬西平長期以來做為廢水處理效率的檢測指標(biāo)，能夠在任何地表水中發(fā)現(xiàn)，因此值得引起關(guān)注。
平行化處理的TPM檢測法用于監(jiān)測DNA內(nèi)嵌相互作用
附著粒子運(yùn)動技術(shù)是一種單分子法，通過對結(jié)合在DNA自由端的粒子的視頻成像監(jiān)測DNA分子的有效長度（DNA的另一端固定在支持物表面）。為了實(shí)現(xiàn)該技術(shù)高通量的潛能，使它具有較高的分辨率，我們設(shè)計了一種單層DNA生物芯片，該芯片由一系列結(jié)合錨定點(diǎn)組成，芯片大小小于1um,可以在使它們保持一定距離互補(bǔ)干擾的情況下，平行檢測幾百個分子。
通過添加與DNA互作的嵌合分子，從而在堿基對之間插入了一個平面芳香基團(tuán)，DNA 會經(jīng)歷結(jié)構(gòu)和力學(xué)上的變化。由嵌合引起的效應(yīng)是堿基對之間距離的增加，可導(dǎo)致DNA分子的延伸，輪廓長度的增加。
這種伸長后引起的運(yùn)動速率會隨著每個堿基對所含嵌合子的數(shù)量比例的增加而提高，并且已發(fā)現(xiàn)對于雙嵌合分子而言，其速率變化可高達(dá)約 50%。相比較裸露的DNA分子，根據(jù)對DNA雙螺旋受到的機(jī)械作用和嵌合子/DNA復(fù)合物電荷的改變，推測DNA的彎曲度也有可能受到影響。由于在彎曲度上有限的改變，我們希望TPM能夠通過直接測量粒子的運(yùn)動幅度的增加而檢測嵌合分子的結(jié)合（請見Fig 1A）。TPM分析按照以下流程進(jìn)行。在 1 分鐘的時間內(nèi)，通過觀測區(qū)域獲取圖像，記錄頻率為每秒 25 幀（請見Fig 1B).一種專業(yè)軟件（Magellium, France)可實(shí)時追蹤所有粒子的位置并計算它們在時間軌跡上的運(yùn)動幅度，記錄間隔為2秒。對于在不同濃度下分析的分子的解決方案，其最終的數(shù)據(jù)點(diǎn)是針對三個獨(dú)立生物芯片所確定的 ΔA 值的平均值（記為 <ΔA>）。<ΔA> 的誤差則取自這三個獨(dú)立結(jié)果之間的標(biāo)準(zhǔn)偏差（請見Fig 1C)。
DNA嵌合分子的高通量單分子檢測法示意圖
通過TPM檢測嵌合染料
我們首先通過分析兩種熒光染料，YOYO-1和SYTOX橙（這兩種染料通過單分子熒光顯微鏡廣泛用于DNA檢測），評估了TPM檢測DNA相互作用嵌合分子的能力。這兩種熒光染料都屬于氰菁染料家族，具有較高的DNA結(jié)合親和性和DNA結(jié)合后熒光強(qiáng)度可提高1000倍的特性。
我們測量了顆粒在1xTE緩沖液中的運(yùn)動幅度，染料濃度范圍從nM到μM，發(fā)現(xiàn)顆粒的運(yùn)動幅度隨YOYO-1和SYTOX橙濃度變化的差異（請見Fig 2)
htTPM檢測兩種DNA嵌合型熒光染料
合成水
我們首先測試htTPM技術(shù)與地表水的兼容性。對河水、泉水和自來水進(jìn)行的測量顯示，A值的變化幅度均小于 5 納米。為了達(dá)到最理想的條件，例如地表水，在確保成分恒定且完全不含雜質(zhì)的前提下，我們自制了一種合成水，用于驗(yàn)證 TPM 檢測嵌入型藥物的能力。這種合成水被稱為“Oriv”（見表 1），其成分如下：
用于htTPM檢測的合成水成分表
TPM檢測溶液中的阿霉素
抗癌藥物阿霉素屬于蒽環(huán)類抗生素這一類別，屬于最早被發(fā)現(xiàn)并廣泛使用的癌癥化療藥物。多柔比星的細(xì)胞毒性來源于對拓?fù)洚悩?gòu)酶II的抑制和接著發(fā)生的DNA相互作用。已知嵌合作用是與DNA相互作用的主要模式，是藥物發(fā)揮活性的主要原因。其相互作用的理化性質(zhì)目前仍是理解多柔比星作用機(jī)制的主要方式。本文中，我們在三種條件下進(jìn)行測試，1xTE緩沖液和1xPBS緩沖液可與相互作用的染料結(jié)果進(jìn)行比較，合成水用于檢測該技術(shù)對地表水檢測的能力。與由插入作用所引起的 DNA 結(jié)構(gòu)變化一致，在這三種基質(zhì)中，隨著阿霉素濃度的增加，顆粒的運(yùn)動幅度呈現(xiàn)出單調(diào)遞增的趨勢，直至達(dá)到飽和狀態(tài)（請見Fig 3)。
htTPM對溶液中藥物阿霉素的檢測結(jié)果
TPM檢測溶液中的藥物卡馬西平
卡馬西平是廣泛使用的抗驚厥藥物，屬于最常出現(xiàn)在地表水中的殘留化合物分之一，其出現(xiàn)頻率之高甚至被認(rèn)為可以作為水生環(huán)境的人為污染標(biāo)志物。盡管其已經(jīng)證實(shí)具有慢性的基因毒性，但是其與DNA相互作用機(jī)制報道仍舊較少。如Fig 4A顯示，在合成水和 1X PBS中，隨著卡馬西平濃度從 0uM升至4uM，跨越40個濃度梯度，均未觀察到A值的變化。考慮到卡馬西平在水中較低的溶解度，我們利用HPLC測量了藥物的濃度。我們首先重復(fù)了已報道的所進(jìn)行的吸光度測量，通過記錄在 1X PBS 緩沖液中加入逐漸提高濃度的含有ctDNA 的卡馬西平溶液的紫外-可見吸光度譜，并將緩沖液的吸光度譜作為參考（請見Fig 4B)。結(jié)果顯示，吸收光譜并未出現(xiàn)任何變化，尤其沒有出現(xiàn)因離子嵌入而產(chǎn)生的藍(lán)色位移特征。其次，我們采用了最新的 Switchsense 技術(shù)進(jìn)行重復(fù)檢測，同樣并未觀測到卡馬西平與DNA相互作用的發(fā)生（請見Fig 4C).
三種技術(shù)對溶液中卡馬西平化合物的檢測結(jié)果
heliX+分子互作分析系統(tǒng)采用switchSENSE®技術(shù)，通過共價偶聯(lián)或標(biāo)簽捕獲方式將感興趣的分子（配體）固定在heliX®芯片上,結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)的自動化工作流程為分子互作提供高效解決方案。
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