研究表明，大部份鈣粘素蛋白家族與疾病，如腫瘤的發生相關。由于細胞之間的黏附需要鈣粘素蛋白同源二聚化，相應的，能夠調節二聚化過程的小分子，將可能成為潛在的治療性藥物。因此，本文介紹了P-鈣粘素特異性小分子的鑒定，作用于P-鈣粘素蛋白介導的細胞黏附過程。雖然該小分子是一種片段化的化合物，但經實驗證明，它可以結合到P-鈣粘素蛋白的凹陷區，此前該位點還未做為藥物靶點。該分子片段能夠阻止一種被稱為X二聚物的中間體形成中的關鍵氫鍵的形成，進而調節了X二聚化的過程。我們的發現將對小分子用于蛋白-蛋白之間的相互作用調節以及蛋白復合物組裝策略產生重要的影響。
蛋白的組裝揭示了幾乎所有生物學過程：1. 已有大量被報道的各種功能復合物的同源或異源結構信息；2. 能夠對蛋白組裝進行調節的調節分子可以做為潛在的藥物或探針，用于進一步研究蛋白的功能。但小分子在調節蛋白-蛋白相互作用及組裝方面存在困難，部分原因如下：首先，蛋白互作通常會牽涉到較大的分子區域，但是，小分子可以進入的區域較小。除此之外，在蛋白-蛋白互作界面，通常不存在明顯的凹槽；缺少能夠指導配體分子設計的天然蛋白互作分子抑制劑存在。細胞通過鈣粘素蛋白家族，一類鈣依賴性的細胞黏附蛋白分子，發生細胞之間的黏附，蛋白的組裝。根據不同的生物組織環境，鈣粘素分子在各種組織的腫瘤發生中發揮作用。P-鈣粘素分子是一種經典的鈣粘蛋白，已發現在許多腫瘤組織中過表達，促進了腫瘤的轉移和增殖。細胞之間的聚集體形成，能夠阻止anoikis和P-鈣粘素蛋白介導的信號通路，這對于腫瘤細胞的存活至關重要。因此，P-鈣粘素蛋白功能的抑制已成為一種潛在的抗癌策略。細胞黏附可以通過不同的細胞間的鈣粘素蛋白反式同源二聚化實現，也可以通過相同細胞間的鈣粘素蛋白的順式聚集而成。對于一些類型I的經典的鈣粘素蛋白，包括P-鈣粘素，反式同源二聚化已經被廣泛的研究。蛋白五個結構域中的兩個細胞外結構域（EC12)經證實在蛋白互作的過程中發揮作用（請見Fig. 1a)。X二聚物，也被稱為鏈-插入二聚物（S-S dimer)，是一種中間過渡狀態，能夠促進最終二聚體的形成。S-S二聚物具有一種特定的結合模式，在該結合模式之下，一個單體N末端的色氨酸殘基可以插入另一個單體的疏水口袋。根據這種模式設計的一些肽類分子模擬配體已有相關報道，但還未有相關的配體分子被鑒定，可能是由于這個疏水口袋在S-S二聚化狀態期間，一直被單體自身或另一個單體的色氨酸殘基所占據，進而影響了對相關分子機制的更進一步深入研究。在體外進行S-S二聚化過程的抑制研究也許不是最好的方法，我們需要考慮其他方式，研究小分子在調節細胞黏附分子組裝方面的功能。
本研究中，我們對這個過程下的任何狀態進行了小分子篩選，該篩選文庫包括類似藥物的小分片段，鑒定出了一種全新的可以特異性與P-鈣粘素蛋白結合的小分子。該化合物分子能夠通過調節X二聚化抑制細胞之間的黏附，間接的抑制了能夠穩定X二聚物的疏水鍵的形成。
該化合物文庫包含1973種化合物。做為初步的篩選，進行了分子之間相互作用檢測。P-鈣粘素蛋白的單體突變蛋白稱為REC12，其中精氨酸被插入到EC12的氨基端，通過生物素-鏈霉親和素捕獲法，被固定在生物傳感器芯片表面，含有100uM化合物的溶液流經生物芯片表面。根據固定的分子水平，REC和化合物的分子量，推測結合應答的RMAX在20RU左右。在1973種化合物文庫中。144種化合物的結合應答效率超過10RU。
作為更進一步的篩選過程，我們將一種稱為EC12的蛋白結構狀態固定在CM5傳感器芯片表面。這種結構是位于單體和S-S二聚體之間的一種平衡態。我們進行了一種稱為ABA的檢測實驗，即A和B兩種溶液都流經芯片表面。2uM的EC12被稱為溶液A，含有上述第一輪篩選后的化合物的溶液為溶液B，濃度為100uM.對于A溶液，單體結合應答以及單體和芯片之間的共價結合應答，都被檢測到；對于B溶液，兩種化合物明顯的抑制了結合應答效率（請見Fig. 1C）。這些化合物破壞了二聚化的形成，使得單體不能共價結合到芯片表面。但只有其中一種化合物，Hit 1, 顯示出了劑量依賴性結合應答。單體突變的KD值約為916uM(請見Fig. 1e）。
Fig. 1 SPR對潛在化合物篩選示意圖
我們進行了X-射線晶體衍射實驗，用以鑒定Hit 1與單體，REC12的結合位點，闡明Hit 1的抑制效應。REC12經結晶后，與終濃度10mM的Hit 1進行結合，該復合物經衍射后分辨率為2.30 ? （請見Fig. 2a, Table 1）。位于EC1和EC2之間的結構域的淺腔內，觀察到了可以用于建模的Hit 1的電子密度分布。Hit 1一經與REC12結合，相對于未結合Hit 1的REC12，其Y140側鏈發生了偏轉（請見Fig. 2b），Y140和Hit 1形成了一個CH–π的相互作用。這里需要注意，無論是結合Hit 1還是未結合Hit 1的REC12結構，都是高度的同型的，因此差異不應來自高度同型的Hit 1時，會有一個水分子位于REC12晶體結構的腔內。因此，與Hit 1結合的啟動效應有可能來自于和Y140殘基的互作以及脫水作用。同時發現，Hit 1和R68, V98, T99, D100和D137存在范德華力引起的相互作用（請見Fig. 2C）。為了更進一步確認在Hit 1結合后的晶體結構中觀察到的電子密度，我們通過SPR相關技術，檢測了REC12 Y140R和Hit 1的結合效應，發現Hit 1未能夠和該突變結合，證實了Y140位點在相互作用中的作用。在結合口袋周圍的數個氨基酸殘基，比如Y140,D100和Q101經報道對于X二聚化至關重要。在X二聚體中，可觀測到Y140和K14，Q101和D100之間存在氫鍵。盡管Hit 1未能直接破壞這些氨基酸殘基之間的氫鍵，但是該區域結構的改變顯著抑制了X的二聚化。
有趣的是，當我們將P-鈣粘素-Hit 1復合物結構與E-鈣粘素結構進行疊加時，我們發現E-鈣粘素的腔室體積小于P-鈣粘素的腔室體積。通過CASTp 30對P-鈣粘素，E-鈣粘素結構和P-鈣粘素單體-Hit 1復合物結構的腔室體積進行測量，也證明了這一點，分別是12.2 ? 3 , 5.4 ? 3 , 21.4 ? 3。該結果表明較之于E-鈣粘素，P-鈣粘素的腔室更適合于結合Hit 1分子。此外，FTPap分析得到的31個結合區域，都存在于P-鈣粘素中。SPR數據同樣表明，Hit 1不與E-鈣粘素結合，但是能夠與E-鈣粘素N140Y突變體結合（請見Fig. 2e）。因此，與Hit 1的結合腔室，能夠做為P-鈣粘素選擇性配體設計的起始點。
Fig. 2 Hit 1與P-鈣粘素蛋白結合位點鑒定
為了檢測Hit 1對X二聚化的影響，本文利用了氫-氘交換質譜分析法（HDX-MS）。該方法能夠檢測在Hit 1存在與否的情況下，X二聚物的互作面有多大程度暴露在溶劑中。在采用 LC-MS 進行檢測之前先進行胃蛋白酶處理，從而能夠從 P-鈣黏蛋白分子的幾乎所有區域分離出肽片段。在Hit 1存在與否的情況下，檢測每一段肽段的HDX比率（氫氘交換比率）。在相互作用界面之一（殘基134-140和137-147）的相應區域，該區域由于在EC12的N端插入了甲硫氨酸，能夠形成X二聚物，但不能形成S-S二聚物，因此抑制了strand-swapping，Hit 1存在時的氫氘交換比率高于未結合Hit 1時（請見Fig. 3a)。該結果表明，Hit 1對X二聚物的互作界面能夠產生影響。
為了進一步研究Hit 1如何影響X二聚化，X二聚物（MEC12）經結晶后，與終濃度10mM的Hit 1進行結合，形成的復合物結構的分辨率為2.45 ?（請見Fig. 3b）。與上述發現Hit 1的過程中相同，能夠檢測到三個獨立的電子密度分布，其中的兩個位于Y140殘基周圍的腔室，如Fig. 2a中所示。另一個位于EC2結構域的交匯處（請見Fig. 3b）。位于腔內的這些 Hit 1 分子與 Y140 形成了π-π相互作用，并與口袋周圍的殘基或水分子形成了氫鍵連接。由于Hit 1分子能夠與X二聚物的腔室結合，與口袋周圍的殘基形成多種非共價相互作用，Hit 1和X二聚物結合的親和性似乎更高。該推測經switchSENSE技術進行了確認。Hit 1分子與EC2結構域交匯處的互作主要產生于范德華力。X二聚化中的Y140周圍的腔室結構與單體的不同，Hit 1的結合模式較單體也有可能存在差異。
與X二聚物無輔因子的狀態相比，與Hit 1結合的X二聚物呈現出較顯著的結構變化。EC1-EC2結構域角度變得平滑，B鏈相對于A鏈發生了轉變（請見Fig. 3c）。該角度的結構變化推測可能是由于兩個Hit 1分子結合在Y140周圍的腔室引起。在 X 多聚體的界面處，K14 的側鏈與 A138 的主鏈之間形成的氫鍵（即在 Hit 1 結合時形成的那一個）被破壞了（請見Fig. 3d），可能導致了兩個單體分子的位置轉變。
為了進一步確認K14側鏈和A138 的主鏈之間形成的氫鍵對X二聚化形成的重要性，本文使用了尺寸排阻色譜 - 多角度光散射，分別測量了X二聚物（MEC12）和X二聚物突變體K14A的分子量。得到的分子量大小分別是X二聚物為33.8kDa, X二聚物K14A突變體為24.2kDa。
由于在Hit 1結合的X二聚物中，K14和側鏈A138之間的關鍵互作被破壞，我們推測X二聚物的結構可能代表著X二聚化形成過程中的一種不穩定狀態。為了檢測無輔因子存在時的X二聚物的不穩狀態或溶液狀態下的動力學，我們進行了分子動力學的模擬。進行了三次各持續 100 納秒的獨立模擬，并通過 Cα 原子的均方根偏差（RMSD）來確認軌跡的收斂性。由此我們計分別計算出了K14A-A138之間我們分別計算的供體氫鍵和受體氧分子之間的距離（請見Fig. 3f），數據表明在頻率分布上存在兩個峰，一個是 2.6 ?，另一個是4.8 ?。這種非對稱特性在所有的軌跡中被檢測到。在Hit 1分子結合下的蛋白晶體結構中，距離則分別為 4.6 和2.6 ?。上述結果表明，在氫鍵形成時，無輔因子狀態下的X二聚物動力學可能存在兩種狀態，與Hit 1結合狀態下的X二聚物的兩種晶體動力學狀態一致。換句話說，apo狀態的 X 大分子能夠呈現出與在晶體結構中與 Hit 1 結合的 X 大分子所呈現的構象非常接近的構象，即便沒有 Hit 1 化合物的存在也是如此。表明，在晶體結構中觀測到的Hit 1結合下的X二聚物的狀態是X二聚化過程中的一種狀態。總的說來，Hit 1的結合可能會通過將X二聚物限定在二聚化過程的一種狀態下，進而干擾對X二聚化非常重要的氫鍵的形成。和orthosteric抑制劑不同，Hit 1不會直接的阻止兩個單體之間氫鍵的形成，而是可能通過改變單體結構，進而阻止氫鍵的形成。
Fig. 3 Hit 1對蛋白二聚化的影響鑒定
我們進一步通過細胞-聚集檢測技術，驗證了Hit 1是否能夠抑制細胞之間的黏附作用。我們通過Flp-In-CHO體系，構建了一種表達P-鈣粘素的CHO細胞系。在該檢測中，除了P-鈣粘素蛋白，細胞外蛋白經胰蛋白酶消化，使得細胞之間的黏附和細胞聚集體的形成僅僅取決于P鈣粘素分子的相互作用。實驗表明，空白對照組CHO細胞之間未能夠形成大的細胞聚集體（請見Fig. 4a，c）。在胰蛋白酶消化后，培養基替換成不含鈣離子的培養基，以防止細胞聚集，通過添加1mM的CaCl2促進細胞聚集。在細胞發生聚集反應后，使用微流控成像(MFI)設備測量細胞聚集體尺寸大小分布。在MFI的測量中，大于40um的細胞聚集體被定義為P-鈣粘素依賴的細胞聚集，因為在EDTA存在時，會有大量的大小在25-40um的細胞聚集體存在。為了對數量進行標準化，通過計算大于40um-100um的顆粒數與大于25-100um的顆粒數的比值實現。在對照實驗中，EDTA能夠抑制大的聚集體（40-100um)的形成，因此細胞黏附取決于鈣依賴性的P-鈣粘素分子的相互作用（請見Fig. 4a，c)。
當同時添加Hit 1和1mM的CaCl 2分子時，聚集體的形成呈現Hit 1濃度依賴的方式（請見Fig. 4b, c)。而當Hit 1加入到已經形成聚集體的培養體系中時，在檢測時間段，形成的聚集體仍舊穩定存在，而EDTA能夠部分的破壞已經形成的聚集體。這些結果說明，Hit 1是通過阻止X二聚化形成過程中兩個單體分子的互作，一旦細胞聚集體形成，Hit 1是無法破壞它們的互作穩定性的。
為了對Hit 1在X二聚化過程中的效應進行量化分析，我們進行了脂質體聚集檢測。我們首先制備了帶有 C 端組氨酸標簽的 X 二聚體（MEC12），然后將該蛋白質與一種基于 DOPC 的脂質體一起孵育，該脂質體中含有 10% 的具有鎳吸附作用的脂質 DOGs-NTA-Ni，并在 EDTA 存在下使 P-鈣黏蛋白分子失活。在這些條件之下，在650nm的吸收光下，未觀測到聚集（請見Fig. 4d）。我們也同時觀測到，脂質的聚集僅僅在MEC12和 CaCl 2都存在時發生（請見Fig. 4d）。一旦CaCl 2添加到溶液中，脂質體聚集，推測是通過被捕獲在脂質體表面的C端帶有組氨酸標簽的X二聚物（MEC12）的二聚化引起，可通過逐漸增加的650nm處的吸光值檢測，該吸光值最后可達到平臺期（請見Fig. 4d）。通過使用一相結合的指數衰減方程模型，計算出了脂質體聚集的觀測速率常數（kobs），以此作為 X 雙聚體化動力學的指標。Hit 1存在時的速率常數(k obs = 0.0033) 顯著低于Hit 1未存在時的速率常數 (k obs = 0.0086)（請見Fig. 4e）。此處需注意，這并非是由于鈣粘分子的激活引起，因為通過DSC測量可知，無論Hit 1存在與否，鈣離子與鈣粘素分子的結合并未被Hit 1所抑制。該結果表明，Hit 1通過間接的破壞對X二聚化形成關鍵的氫鍵，抑制了X二聚化的過程，進而抑制了細胞的聚集。
我們利用兩種細胞系分析了Hit 1對于內源性P-鈣粘素分子介導的細胞黏附的效應，以及對于不表達P-鈣粘素分子的細胞聚集效應。其中HCT116表達內源性P-鈣粘素分子，MCF7細胞不表達P-鈣粘素分子。將細胞種植在培養板中，并添加100uM的Hit 1分子，細胞聚集程度通過對整體區域面積下的聚集體進行定量分析。由于HCT116和MCF7的每一個單細胞區域都不同，標準化后的細胞區域經Hit 1存在時，每一個濃度下的整體細胞區域比上Hit 1不存在時整體細胞區域計算得到。在100uM的Hit 1存在時，HCT116細胞標準化后的細胞區域，下降到未加入Hit 1時的細胞區域的75.7%，但Hit 1對MCF7細胞標準化后的區域沒有產生影響（請見Fig. 4f）。已有研究報道，P-鈣粘素蛋白敲除后對腫瘤轉移具有一定的影響，以及對細胞內信號通路的影響。本研究中結合已有的表型研究表明，在表達P-鈣粘素分子的腫瘤細胞中，Hit 1能夠抑制細胞之間的黏附作用，進而導致β -catenin信號通路的下調及細胞凋亡信號的激活。
Fig. 4 Hit 1抑制細胞黏附檢測
由于Hit 1以及初篩鑒定的許多化合物都包括陽離子功能基團，我們因此通過基于吲哚的商業化合物：tryptamine, tryptophan, 和 auxin 鑒定了陽離子功能基團對于結合活性的重要性（請見Fig. 5a）。令人驚訝的是，只有tryptophan與 P-鈣黏蛋白結合，這可能是由于Hit 1結合口袋周圍蛋白表面存在著負電荷。該結果表明，在進一步的藥物發現中，不應對陽離子基團進行修飾改造。根據Hit 1和P-鈣粘素蛋白的2D相互作用圖譜的研究（請見Fig. 2c），我們制定了兩個進一步合成的策略：（1）將吲哚環第二個位置的甲基替換成羧基，這將導致羧基和R68，氨基和D137之間形成鹽橋；（2）將吲哚環中 C5 位置的氯原子替換為一種更大分子量的官能團，抑制第二個單體的接近。我們首先合成了3-(2-氨基乙基)-5-苯基-1H-吲哚-2-羧酸（簡稱 Hit 1-羧酸，請見Fig. 5b），但是從SPR親和性檢測來看，它與REC12的親和性并不優于Hit 1，也不具備細胞聚集抑制效應。接下來，我們合成了 2-(2-甲基-5-苯基-1H-吲哚-3-基)乙烷-1-胺（苯基-Hit 1）（請見Fig. 5b)。通過SPR互作檢測分析，我們觀測到一種劑量依賴性應答；其與REC結合的親和性與Hit 1相同。在脂質體聚集檢測中，苯基-Hit 1相比較于Hit 1,具有更強的抑制活性。tryptamine, auxin 和 tryptophan對聚集效應影響較?。ㄕ堃奆ig. 5c）。Tryptamine 不具有大的功能基團，這可能是它不能抑制脂質體聚集的原因。在細胞聚集檢測中，苯基-Hit 1相較于Hit 1具有更強的抑制效應，且苯基-Hit 1與X二聚體的結合親和性要強于單體P-鈣粘素蛋白。
Fig. 5 抑制劑設計策略
