腫瘤球或微腫瘤是重要的三維體外腫瘤模型，與二維細胞培養相比，它們與腫瘤在體內的“微環境”極為相似。微腫瘤在基礎癌癥研究、藥物發現和精準醫學等領域得到了廣泛應用。在精準醫學中，源自患者腫瘤細胞的腫瘤球體為藥物敏感性和耐藥性測試提供了一種有前景的系統。已建立的基于 96 和 384 孔微孔板的細胞球體常規篩選平臺需要相對較多的細胞和化合物，并且每個培養皿中往往會形成多個球體。本研究展示了基于親水-超疏水圖案化技術的微滴陣列平臺與懸滴法相結合的應用，用于構建高度微型化的單球體微陣列。以幾種常用的癌細胞系開始，在 100 nL ，含 150 個細胞的微滴中培養，24 至 48 小時內即可形成球體。該方法具有潛在應用價值，可用于 3D 癌癥球體或微腫瘤的高通量化合物篩選，這對于基礎癌癥研究、藥物發現和精準醫學領域至關重要。
本研究所用DMA玻片為經過親水與超疏水處理的玻璃玻片。親水位點被超疏水區域間隔開。玻片為25 X 75 mm，包含588個邊長為1 mm的親水位點（圖2A、B）。
在此，我們同時采用了不連續的去濕技術（圖 1A上半部分）和非接觸式噴頭來將細胞直接打印到每個親水性點上（圖 1A下半部分）。如果是手動種細胞，細胞會被置于約 80 納升的液滴中，如果是使用機器接種，細胞會被置于 100 納升的液滴中。細胞接種完成后，將 DMA 玻片翻轉過來并放置在載玻片支架上，以形成懸掛液滴陣列（圖 1A和 2B）。帶有 DMA 玻片的載玻片支架被放入一個裝有緩沖液的 10 厘米培養皿中，并用含有濕潤墊的蓋子封閉，在標準細胞培養箱中進行培養，防止培養過程中液滴的蒸發。24-48小時后即可形成單球陣列（圖2C、D）。這種單細胞球體陣列可用于進行復合操作，在 DMA 玻片上直接進行顯微鏡分析，每個球體都可以單獨進行定位（圖 1B）。此外，還可以通過將球體從無壁表面沖洗至培養皿或其他容器中來輕松收集它們，以便進行進一步的實驗或分析（圖 1C）。因此，DMA 技術不僅可以作為球體篩選的平臺，還可以作為制造數百個均勻單球體的平臺，這些單球體還可用于各種應用。
我們成功地從多種細胞類型（包括 MCF-7、HEK293 和 HeLa 細胞）中形成了球體（圖 2C 和 3）。
形成的球體在陣列中的大小分布與泊松分布相符，直徑偏差約為 14%，且兩種手動和自動接種方法的結果相當（圖 2D）。在手動和自動接種方法中（圖 2D）。球體的大小取決于液滴中初始細胞的數量，并且可以通過改變初始細胞接種濃度來控制（圖 3C）
我們在不更換培養基的情況下對球體的生長和活力進行了為期數天的監測（圖 3A、B、E、F）。在培養 24 至 96 小時期間，HeLa 球體的直徑從 70 ± 10 微米增加到 100 ± 15 微米，而 HEK 293 球體的直徑則從 170 ± 10 微米減小到 140 ± 10 微米，MCF-7 球體的直徑則從 140 ± 20 微米減小到 110 ± 20 微米（圖 3A、B）。對于 HEK293 和 MCF-7 細胞系而言，細胞在培養初期就在液滴中心形成了較大的細胞團塊，隨后在球體形成過程中細胞會逐漸緊密排列。這種在培養的前 2-3 天內球體緊縮的過程已在之前得到證實。
接下來，我們對由HeLa細胞形成的球體進行了三種不同抗癌藥物（多柔比星、奧沙利鉑和 5-氟尿嘧啶）的處理，并比較了HeLa球體和在二維單層培養中生長的HeLa細胞的劑量反應情況（圖 4）。使用液體分配器將HeLa細胞以每 100 納升滴液 150 個細胞的量接種，并在懸滴中培養 48 小時使球體形成。之后，用50 納升藥物處理球體并將液滴陣列培養 72 小時。對于2D細胞培養，我們將HeLa細胞用液體分配器接種到 DMA 玻片上，并正置培養 5 小時以使細胞附著在表面，然相同的化合物處理，再培養 72 小時。最后，我們用鈣黃綠素和碘化丙啶（PI）對細胞進行染色，分別用于可視化活細胞和死細胞。以3D和2D形式培養的細胞，圖 4 中顯示了劑量反應曲線，表明這三種化合物對HeLa細胞的活力都有明顯的劑量依賴性影響。（圖 4）。3D培養的細胞比2D單層培養中的細胞更具耐藥性（圖 4），各地此前已有多次報道指出，與相同類型的單層培養細胞相比，腫瘤球體對抗癌化合物的抵抗力更強。
該研究在某些應用中具有諸多優勢，尤其適用于在納升滴體中對單個分離的球體進行快速和高通量篩選，便于批量制造腫瘤球體。例如，將每個滴滴的體積縮小至 100 納升，可使化合物、試劑和細胞的使用量相比微孔板節省高達 99%。這種成本的顯著降低可能會為在藥物開發的早期階段進行主要的超高通量篩選提供可能性，因為在這一階段會測試數百萬種化合物進行表型篩選。每個球體只需使用 150 個細胞，這對于處理罕見且難以擴增的細胞（如原代患者來源的腫瘤細胞）來說尤為重要。研究中使用的球體大小在 50 至 1000 微米之間不等。
研究表明，即使是直徑小于 100 微米的非常小的球體，在培養 2 天后也會出現氧梯度，并且會發展出缺氧狀態以及缺氧反應元件（HRE）的激活現象，這證實了它們與體內腫瘤在生理上的相似性。微滴陣列平臺具有靈活性，能夠通過改變初始細胞數量和親水性斑點的大小來培養不同大小的球體。研究表明，不同大小的球體對藥物治療的反應可能不同，因此，應根據應用選擇合適的球體大小。在本研究中，我們的目標是展示低起始細胞數量形成和篩選球體。這使得該系統在藥物敏感性和耐藥性測試方面具有吸引力。DMA 平臺特別適合形成具有統一球體大小的單個球體微陣列，這與包括 ULA 板在內的許多其他方法不同，因為在 ULA 板中，每個孔中形成的球體的數量和大小是無法確定的。另一個優點是可以直接在 DMA 蓋片上對球體進行顯微鏡觀察，而無需將其轉移到微孔板中。由于小液滴的尺寸，球體的定位是固定的，這也簡化了顯微鏡觀察和圖像處理。最后，形成的均勻的細胞球體可以方便地收集到一個容器中，以供進一步實驗使用，這對于從體外測試到再生醫學等各種應用都非常重要。因此，本文所建立的單球體微陣列可以用于基礎研究、藥物發現以及精準醫學的篩選工作流程中。
