納升級(jí)液滴精準(zhǔn)分配：通過I.DOTOne分配器，將hiPSCs懸液以200nL/滴（單滴含約100個(gè)細(xì)胞）非接觸式接種至DMA親水斑點(diǎn)，細(xì)胞數(shù)變異系數(shù)（CV）<5%，避免傳統(tǒng)移液的交叉污染（污染率<0.01%）。

非接觸式操作規(guī)避污染：I.DOT精準(zhǔn)分配Rock抑制劑（Y-27632）與培養(yǎng)基，在無Matrigel的TA/TBDMA表面形成獨(dú)立微滴培養(yǎng)單元，單玻片集成672個(gè)親水斑點(diǎn)，實(shí)現(xiàn)高通量平行培養(yǎng)。

多維度表征與功能驗(yàn)證：結(jié)合I.DOT的納升級(jí)試劑分配能力，同步進(jìn)行活死染色（CalceinAM/PI）、免疫熒光（Nanog/TRA-1-81）及qPCR檢測，精準(zhǔn)量化細(xì)胞活力與多能性基因表達(dá)。

無Matrigel存活達(dá)70%-76%：I.DOT分配的200 nL微滴中（圖1），hiPSCs形成緊密克隆團(tuán)，核質(zhì)比與形態(tài)均與Matrigel培養(yǎng)一致，證實(shí)I.DOT精準(zhǔn)控制的微體積環(huán)境可替代動(dòng)物基質(zhì)支持細(xì)胞黏附（圖2）。

圖1.實(shí)驗(yàn)表面特性與研究工作流程示意圖

(A)本研究使用了兩種市售表面，A型（TA）和B型（TB）。“TA和TB表面”是指用于培養(yǎng)2mL體積的hiPSC的大面積（2.5cm×7.5cm）親水表面。“TA和TBDMA”是指含有分別具有TA和TB涂層的親水性斑點(diǎn)陣列的DMA。DMA平臺(tái)具有標(biāo)準(zhǔn)顯微鏡載玻片的尺寸，并且由在超疏水背景上的邊長為1mm的方形親水斑點(diǎn)陣列組成。在TA和TBDMA上以200nL體積培養(yǎng)細(xì)胞。(B)所執(zhí)行研究的工作流程。作為第一步，使用水接觸角（WCA）測角法、能量色散X射線光譜（EDX）、掃描電子顯微鏡（SEM）、原子力顯微鏡（AFM）和X射線光電子能譜（XPS）表征TA和TB表面。。作為第二步，在TA和TB表面上的2mL培養(yǎng)基中以及在TA和TBDMA上的200 nL培養(yǎng)基中培養(yǎng)hiPSCs。作為第三步，研究了在不同表面上培養(yǎng)的hiPSCs的形態(tài)、活力和多能性。

圖2.不同打印壓力對細(xì)胞活力的影響

在通過ReLeSR?分離之前，將HiPSC在6孔板中的mTeSRplus培養(yǎng)基中培養(yǎng)。然后使用75、150和300mbarms的壓力將分離的細(xì)胞分配到DMA點(diǎn)上，體積為200nL/點(diǎn)。將細(xì)胞在DMA載玻片上培養(yǎng)24h，然后加入鈣黃綠素AM和PI進(jìn)行活/死染色。細(xì)胞活力計(jì)算為鈣黃綠素AM陽性面積與鈣黃綠素AM和PI陽性面積之和的比率。(A)在TA上印刷并培養(yǎng)24小時(shí)的hiPSC的活力（n=3個(gè)生物學(xué)重復(fù)）。(B)接種到TADMA上并培養(yǎng)24小時(shí)的hiPSC的代表性熒光圖像。比例尺：100μm。(C)打印到TBDMA上并培養(yǎng)24小時(shí)的hiPSC的活力（n=3個(gè)生物學(xué)重復(fù)）。(D)接種到TBDMA上并培養(yǎng)24小時(shí)的hiPSC的代表性熒光圖像。數(shù)據(jù)表示平均SD。比例尺：100 μm。

高通量篩選效率躍升：單玻片日處理100+樣本，試劑消耗較96孔板降低600倍，I.DOT的非接觸式分配避免了手動(dòng)操作誤差，細(xì)胞活力檢測變異系數(shù)（CV）僅3.2%，數(shù)據(jù)可靠性提升4倍。

Nanog表達(dá)提升5-7倍：I.DOT精準(zhǔn)控制的微滴培養(yǎng)中，hiPSCs的多能性核心基因Nanog、Oct4、Sox2表達(dá)均顯著高于2mL傳統(tǒng)培養(yǎng)，無Matrigel組Nanog蛋白熒光強(qiáng)度僅比Matrigel組低15%（圖3），揭示I.DOT介導(dǎo)的微體積效應(yīng)協(xié)同表面特性維持干細(xì)胞未分化狀態(tài)。

圖3.不同打印壓力對細(xì)胞活力的影響

在不同條件下培養(yǎng)的細(xì)胞的hiPSC多能性的比較。(A)對在MGB1表面上培養(yǎng)的hiPSC的Nanog表達(dá)的免疫熒光（IF）染色（MGC10，2 mL細(xì)胞培養(yǎng)基），MGC10DMA（MG培養(yǎng)基，200nL細(xì)胞培養(yǎng)基），MGTA表面（MGTA，2 mL細(xì)胞培養(yǎng)基），MGTB表面（MGTB，2mL細(xì)胞培養(yǎng)基）、MGTADMA（MG-TA，200nL細(xì)胞培養(yǎng)基）、MGTBDMA（MG-TA，200 nL細(xì)胞培養(yǎng)基）。細(xì)胞核用DAPI（藍(lán)色）復(fù)染（n1/43個(gè)生物學(xué)重復(fù)）。比例尺：20 μm。(B)通過ImageJ測量每個(gè)實(shí)驗(yàn)組的NanogIF染色的平均熒光強(qiáng)度。隨機(jī)選擇每個(gè)實(shí)驗(yàn)組的三張圖像并進(jìn)行分析。數(shù)據(jù)表示平均SD。*P<0.05，2 mL和200 nL組之間的顯著差異。(C)通過對從在不同表面和體積上培養(yǎng)的細(xì)胞分離的RNA進(jìn)行qPCR分析來研究多能性特異性基因Nanog的表達(dá)（n/43個(gè)生物學(xué)重復(fù)）。將所有基因表達(dá)相對于參考基因GAPDH標(biāo)準(zhǔn)化，并表示為平均SEM。**P<0.01，2 mL和200 nL組之間的顯著差異。

表面化學(xué)修飾的精準(zhǔn)調(diào)控：通過I.DOT在含硫（TA）與含氟（TB）表面的差異化分配（圖4），發(fā)現(xiàn)TB表面培養(yǎng)的hiPSCs Nanog表達(dá)略高，暗示I.DOT可結(jié)合表面化學(xué)特性，精準(zhǔn)調(diào)控干細(xì)胞信號(hào)通路（如整合素-黏附分子通路）

圖4. TA和TB表面的表征。

TA和TB表面的表征。(A)在環(huán)境條件（25℃）下，用8μL水滴測量親水性TA和TB表面的水接觸角（WCA）。數(shù)據(jù)代表平均SD（n?3）。(B)TA和TB表面的能量色散X射線光譜（EDX）。表面涂有碳以確保導(dǎo)電性。在TA表面上檢測到硫峰，在TB表面上檢測到氟峰。(C)利用掃描電子顯微鏡觀察了TA和TB的表面形貌，并對襯底不同位置上納米Si晶粒進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)。比例尺：2μm。(D)采用原子力顯微鏡（AFM）對樣品的表面形貌進(jìn)行表征.表面粗糙度（Ra）由AFM高度輪廓（n?3）確定。(E)測量了TA表面的掃描X射線光電子能譜（XPS），以及TA表面C1s和S2p的XPS譜。(F)測量了TB表面的掃描XPS譜，以及TB表面上C1s和F1s的XPS譜。