在缺乏ATR激酶的情況下，模擬的磷酸化的蛋白FANCI仍舊可以促進FANCD2的泛素化，這說明ATR激酶通路實質上是通過促進FANCI的磷酸化激活FA信號通路，促進FANCD2的泛素化發生。那么磷酸化是如何影響泛素化發生的呢？為了回答這個問題，本文純化了三種蛋白：模擬的來源于雞的FANCI磷酸化蛋白（簡稱D2-I 3D），在該蛋白中，三個保守的磷酸化位點，絲氨酸558，絲氨酸561和蘇氨酸567，被突變成天冬氨酸；野生型的FANCI蛋白（D2-I WT）和失去被磷酸化功能的FANCI蛋白（D2-I 3A），在該蛋白中，上述三個保守位點被突變成丙氨酸。

這三種蛋白對于FANCD2的泛素化分別有什么影響呢？本文進行了體外的泛素化檢測，在44bp的dsDNA和重組的FA核心蛋白復合物存在的情況下，WT和I-3A對FANCD2的泛素化影響是相一致的，在20分鐘內，約40%的FANCD2發生了泛素化；而I-3D的泛素化效率明顯提高，在10分鐘后，約75%的FANCD2蛋白發生了泛素化，20分鐘后，大于95%的FANCD2發生了泛素化。這些結果說明，FANCI的磷酸化可以促進FA對FANCD2的泛素化作用。

ATR的磷酸化位點位于FANCI的靈活可變區域，與FANCI的泛素化位點，FA核心復合物成分，Ube2T及USP1-UAF1結合位點相鄰，報道將其稱為“磷酸環”。在非泛素化的鼠的D2-I晶體結構中，磷酸環位于FANCD2和FANCI蛋白互作界面，處于一個氫鍵構成的網絡之中；但并沒有相關的電鏡結構數據，說明磷酸環的內部是靈活可變的，并不容易進行相關的結構解析。

為了從結構的角度分析FANCI的磷酸化是如何促進FANCD2泛素化的發生，本文對D2-I 3D，D2-I3D和DNA，泛素化的D2-I 3D和DNA進行了電鏡結構解析，其分辨率分別是4.1，3.5和4.4?.  D2-I 3D在沒有DNA存在的情況下，在結構上呈現的是更加“打開”的狀態，這說明磷酸化本身并不能改變蛋白復合物的結構狀態，但是在DNA存在的情況下，泛素化的D2-I 3D與DNA結合上呈現的是更加緊湊的狀態。那么是泛素化的發生，還是DNA存在的本身，對D2-I 3D的結構產生了影響呢？影響的意義是什么呢？在DNA存在的情況下，D2-I 3D與DNA的結合呈現了緊湊的狀態，這與之前的研究結果相悖，已有的報道發現非泛素化的DNA-D2-I結合復合物中，D2-I呈現的是“打開”的狀態，緊湊的結構狀態是由于泛素化得到發生而引起的。

本文構建了一個DNA-D2-I 3D復合物模型，并將其與已報道的D2-I的結構進行比較。除了FANCD2的可變的N端區域，D2-I 3D的緊湊狀態并不影響單個亞基的總體結構狀態。為了實現與DNA結合的緊湊狀態，FANCD2和FANCI 3D會繞著它們N端形成的鉸鏈進行旋轉，使得它們的蛋白C端可以接近，進而發生互作，并與DNA形成一個新的相互作用界面。結合上述的數據結果表明，FANCI的磷酸化在DNA存在的情況下，可以促進D2-I復合物與DNA結合的緊湊性，DNA在其中的作用，可能充當一個旋轉軸心的作用，或是類似于支架的作用；如果沒有DNA的存在，這種旋轉并不會發生，新的互作界面也不會發生。

那么這種緊湊的結構狀態的發生的意義是什么呢？由于結構的改變，使得FANCD2和FANCI隱藏的泛素化位點暴露，FA核心復合物復合體成分可以與其發生作用。

以上結構數據表明，磷酸化通過以下機制促進了D2-I的泛素化：磷酸化的蛋白復合物，在dsDNA存在的情況下，發生結構上狀態的變化，從“打開”的狀態轉變為“緊湊”的狀態，這種轉變，暴露了關鍵的泛素化位點Lys563。

除了結構上的改變，促進了泛素化的發生，那么FANCI的磷酸化是否影響了復合物與DNA結合的動力學，比如降低解離率，延長復合物與DNA互作的時間等。已有的研究發現，模擬的FANCI磷酸化突變通過增加復合物與DNA結合的親和性，促進FANCD2的泛素化。為了進一步驗證D2-I 3D和野生型復合物D2-I與DNA結合的親和性差異，我們通過凝膠遷移滯后實驗（EMSA）檢測D2-I WT，D2-I 3A和D2-I 3D與DNA結合的親和性。但是，本文并沒有檢測到明顯的差異。

本文考慮到EMSA技術受限于分辨率，對細微的差異無法進行檢測。例如，比較慢的結合/解離與較快的結合/較快的解離可能具有相似的親和性。因此，我們采用了SwitchSENCE技術對上述復合物進行了實時動力學檢測。SwitchSENCE采用熒光標記的DNA納米桿，納米桿固定在芯片表面，并處于可變的電場之中。當待結合的蛋白經微流控液流流經芯片表面時，DNA和蛋白結合的實時動力學可以通過檢測DNA納米桿在電場中的熒光改變速度進行測量。由于雙鏈DNA納米桿一端固定在芯片上，另一端設計成環狀結構，因此可以避免蛋白復合物從DNA鏈上的滑落，導致數據產生的復雜性和不可控性。結果顯示，三種不同的復合物在結合/解離動力學上不存在明顯的差異。但相比較于EMSA，對于三種復合物，SwitchSENCE測得的親和性更加高，這也可能是由于DNA存在形式的差異。

以上結果說明，復合物的磷酸化狀態并不能明顯改變其與DNA結合的動力學。

雖然已經驗證復合物的磷酸化可以影響其開合狀態，但是否與其泛素化的發生相關，并不清楚。本文認為D2-I的磷酸化主要是通過影響發夾結構的開合狀態影響復合物的泛素化。為了檢測FA核心復合物蛋白與D2-I WT和D2-I 3D結合的差異，我們在DNA缺失或在限制濃度下進行泛素化檢測。首先，在DNA缺失的情況下，D2-I WT復合物并不能有效的發生泛素化，2小時反應，僅有大約5%發生了泛素化反應。但是D2-I 3D發生泛素化的速率是D2-I WT的10倍左右，即使在DNA缺失的情況下。所以，泛素化的發生依賴于磷酸化，但是否依賴于DNA呢？或則磷酸化本身是依賴于DNA存在的呢？有限的DNA的加入，促進了D2-I 3D的泛素化，但對D2-I WT并未產生影響。這說明，泛素化依賴于復合物的磷酸化，但DNA的存在可以極大的促進該泛素化過程。DNA是通過什么機制促進這一泛素化過程的呢？DNA在該過程中的作用是什么呢？本文推測是起到穩定復合物“緊湊”的狀態。

為了更進一步從構象的角度探究D2-I WT和D2-I 3D的存在差異，我們通過定量交聯質譜對溶液中的復合物狀態進行分析。我們使用一種半衰期較短，UV-激活的異源雙功能交聯劑sulfosuccinimidyl 4,4’-azipentanoate (sulfo-SDA），在DNA存在與否的情況下，對D2-I WT和D2-I 3D復合物分別進行交聯，可以獲得短時狀態下的分子內部互作狀態。對于D2-I 3D復合物來說，DNA不存在時的交聯模式和構象狀態與兩種復合物DNA存在時的差異比較一致，但與DNA不存在時，D2-I 3D的差異比較明顯。這說明，磷酸化與DNA分子都是影響復合物構象狀態的因素。那么磷酸化因素是如何影響復合物構象狀態的呢？本文在DNA缺失的情況下，對D2-I WT和D2-I 3D分別進行了定量交聯質譜分析。結果發現，兩種復合物在DNA缺失的情況下，形成了相似的構象，但是特定的交聯數量存在差異，說明在構象的狀態上存在一定的差異。

通過更精細的數據分析，本文發現，在D2-I WT和D2-I 3D兩種復合物的構象狀態方面主要存在兩種主要的差異。首先，不同的交聯簇表明兩種復合物的無序N端位置上的不同；在D2-I WT復合物中，FANCD2的N端與FANCI的patch交聯，該位置位于D2-I復合物互作界面，并與磷酸環和FANCI-K525氨基酸相接近。這種交聯的狀態在D2-I 3D復合物中并不是主要的交聯，相反，其與FANCI交聯的區域與復合物互作界面相距較遠。

以上數據進一步表明，磷酸化和DNA的結合對復合物D2-I具有相似的效應，改變其N端序列的交聯狀態，促進復合物轉變為更為“緊湊”的狀態。

其次，在泛素化位點附近，具有特定的交聯模式。我們知道，在D2-I復合物的“打開”狀態中，這些關鍵的泛素化位點未經暴露，在D2-I 3D復合物中，交聯模式的改變，使得這些氨基酸殘基發生暴露，使得FA復合物蛋白更易與其接近。

除了復合物N端的交聯狀態，本文也同時對C端的交聯模式進行了分析。這種交聯僅在DNA存在的情況下，復合物呈現更為”緊湊“的狀態時發生。D2-I WT和D2-I 3D在DNA存在時，都可以圍繞DNA形成“緊湊”狀態，但在D2-I 3D復合物中，比起D2-I WT，C端交聯高達3倍的富集程度。表明在D2-I 3D復合物中，“緊湊”狀態的維持時間，長于D2-I WT。

通過以上結果，本文證實，D2-I復合物存在“開”和“合”的構象動態平衡，無論DNA存在與否。與DNA結合導致的效應相似，磷酸化可以改變復合物的構象平衡，促進復合物從“打開”狀態向“緊湊”狀態的轉變。