細胞周期(cell cycle)是指細胞從一次分裂完成開始到下一次分裂結束所經歷的全過程,分為間期與分裂期兩個階段,其中間期又分為三個階段:G1、S和G2,如果細胞在G1期受到調控阻留,則會轉入G0期脫離細胞周期,在G0期的細胞仍然有進入細胞周期分裂的潛力。
G1期又稱合成前期,物質代謝活躍,迅速合成RNA和蛋白質,主要為下階段S期的DNA復制作好物質和能量的準備;S期即DNA合成期,合成DNA和組蛋白,DNA復制所需要的酶都在這一時期合成;G2期為DNA合成后期,是有絲分裂的準備期,DNA合成終止,大量合成RNA及蛋白質。
處在G2期的細胞DNA含量為G1期細胞的兩倍,可以通過DNA含量來區分兩種不同的細胞。此外,大量文獻證明,處在G2期的細胞體積大于G1期的細胞。因此我們可以通過細胞體積和DNA含量兩個指標來進行G1和G2期的細胞分選。實驗中采用的DyeCycle Green是一種細胞滲透性DNA染料,DyeCycle Green熒光信號越強則表明細胞中DNA含量越高,FSC和BSC信號則與細胞大小有關。
WOLF細胞分選儀能夠利用DyeCycle Green熒光強度表現細胞中DNA含量,由于DNA結合染料具有細胞毒性,會干擾基因組檢測,因此我們僅使用這種染料作為散點圖中G1門的框選步驟。如下圖所示,首先在G1峰繪制一個門并突出顯示為藍色,查看FSC/BSC散點圖上G1細胞出現的位置,然后在FSC/BSC散點圖中藍色突出顯示細胞處繪制一個G1細胞門。
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使用WOLF單細胞柔性分選儀對這個門中的細胞進行富集分選,收集到的細胞再進行回測,得到下圖左側結果,可以看出富集后G1門中的細胞占比從45.4%提升到了91.8%。
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分選后的G1細胞繼續進行24 h的培養,分選所得細胞的初始活率為90.1%,經過24 h的培養后,活率約為74%(下圖左)。在24 h培養后對分選所得細胞又進行了一次分析,細胞仍保留了分裂功能,已經有部分細胞進入S期和G2期(下圖右)。
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通過同樣的圈門邏輯我們也可以進行G2細胞的分析和分選,使用DyeCycle Green熒光強度表現細胞中DNA的含量,DNA含量高的細胞則被認為是處于G2期的細胞,G2期細胞標記為紅色,G1期細胞標記為藍色(下圖)。
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綜上,WOLF被證實可以溫和且準確的分選處于細胞周期不同階段的活細胞,分選后的細胞能夠有很高的純度和活性。而且,經過 24 小時的培養后,細胞看起來很健康,并能夠繼續進入細胞周期的后續階段,進一步證明了這些細胞在WOLF上分選后仍能保持分裂功能,這一工作流程同樣適用于其他類型的細胞。
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