質(zhì)量光度法（MP）可量化溶液中生物大分子的質(zhì)量分布。它在分析生物樣本的純度、完整性和原始條件下的功能方面的用途已經(jīng)被證明，在本應(yīng)用說(shuō)明中，將證明質(zhì)量光度法在變性條件下，是研究低聚蛋白質(zhì)變性和再變性的有用工具。

為了舉例說(shuō)明質(zhì)量光度法在解除/重折疊實(shí)驗(yàn)中的優(yōu)勢(shì)和局限性，我們進(jìn)行了一個(gè)關(guān)于烯醇化酶的案例研究。質(zhì)量光度法是一種超靈敏的單分子質(zhì)量分析技術(shù)，可檢測(cè)溶液中的蛋白質(zhì)（或其他生物分子）在玻璃-水界面上的散射信號(hào)。與玻片結(jié)合粒子的散射光量取決于粒子的質(zhì)量而非形狀，所以無(wú)論蛋白質(zhì)是折疊還是展開(kāi)，因其質(zhì)量不會(huì)改變，質(zhì)量光度讀數(shù)也不會(huì)改變。

烯醇酶在原生和變性條件下的MP測(cè)量結(jié)果表明，MP對(duì)蛋白質(zhì)的折疊狀態(tài)并不敏感。在原生條件下，烯醇酶主要形成90 kDa質(zhì)量的同源二聚體和一些45 kDa質(zhì)量的單體。在變性條件（尿素）下，二聚體分離成未折疊的單體，但同預(yù)期一樣，用MP測(cè)量的未折疊單體的質(zhì)量（45 kDa）與折疊單體的質(zhì)量相同（下圖）。MP對(duì)折疊狀態(tài)不敏感，因此是監(jiān)測(cè)折疊依賴(lài)性低聚物的一種可行方法。

蛋白質(zhì)解折疊實(shí)驗(yàn)通常是在變性劑濃度非常高的情況下進(jìn)行的。然而，尿素和GdnHCl 在水溶液中濃度較高時(shí)，會(huì)形成氫鍵團(tuán)簇，因?yàn)閳F(tuán)簇的光學(xué)性質(zhì)與周?chē)芤旱墓鈱W(xué)性質(zhì)不同，這種團(tuán)簇可以用MP觀(guān)察到。這種差異會(huì)導(dǎo)致背景光散射，在MP圖像中顯現(xiàn)，隨著尿素濃度的增加，圖案及其相應(yīng)的信號(hào)也隨之增加，直到尿素濃度超過(guò)1 M時(shí)達(dá)到一個(gè)峰值（下圖）。

來(lái)自團(tuán)簇的圖案信號(hào)代表背景噪聲，會(huì)增加使用MP測(cè)量生物大分子質(zhì)量的難度，甚至可能無(wú)法量化散射信號(hào)。因此，在使用變性劑時(shí)，檢查背景信號(hào)非常重要，這將為實(shí)驗(yàn)設(shè)定噪聲基線(xiàn)。當(dāng)變性劑被稀釋時(shí)，MP可以為變性過(guò)程提供更可信的信息，從便監(jiān)測(cè)低聚蛋白質(zhì)的重折疊動(dòng)態(tài)。變性烯醇酶樣品經(jīng)PBS稀釋恢復(fù)到接近原生狀態(tài)后，MP敏感捕捉到了這一轉(zhuǎn)變（下圖），這得益于MP檢測(cè)的的快速性及其在寬濃度范圍內(nèi)的準(zhǔn)確性。實(shí)驗(yàn)中還利用MP技術(shù)監(jiān)測(cè)了變性烯醇酶樣品的重折疊動(dòng)態(tài)，發(fā)現(xiàn)二聚體在稀釋后的 60分鐘內(nèi)逐漸重新形成（下圖）。

二聚體的恢復(fù)動(dòng)態(tài)可通過(guò)繪制單體/二聚體比率與時(shí)間的函數(shù)關(guān)系圖來(lái)觀(guān)察。恢復(fù)速度取決于所使用的變性物質(zhì)，可以看出，用GdnHCI變性的烯醇酶恢復(fù)得更快（下圖）。

綜上所述，質(zhì)量光度法能夠提供有關(guān)生物大分子和復(fù)合物的質(zhì)量和組成的準(zhǔn)確信息，是一種監(jiān)測(cè)多聚復(fù)合物中蛋白質(zhì)變性和再變性過(guò)程的簡(jiǎn)單方法，并且能夠輕松比較變性劑的效果。

Refeyn Two ^MP與 Refeyn Samux^MP是基于質(zhì)量光度法（MP）技術(shù)的臺(tái)式單分子質(zhì)量分析系統(tǒng)，其機(jī)身緊湊，安裝簡(jiǎn)便。僅需消耗幾微升樣品和潔凈的玻片，就能直接測(cè)量溶液中單個(gè)分子的質(zhì)量，并且無(wú)需任何標(biāo)記，為生物分子檢測(cè)創(chuàng)造了無(wú)限可能。

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