測序成本的大幅降低使更多的研究人員在他們的研究領域特別是在微生物生態學領域利用下一代測序技術了解微生物棲息地的多樣性。當前大型測序項目的成本受到實際操作時間和樣品制備成本的限制。然而，利用液體處理程序和液滴分配技術的新的自動化或半自動化工作流程在減少工作時間和縮小反應量方面很有發展前景——最終降低成本。

由于土壤樣本的多樣性，因此對于高通量DNA（HT）提取工作流程來說尤其成問題。此外，由于步驟難以自動化、耗時或包含有害物質，大多數常規操作手段并不適用于高通量測序。雖然有幾種商業的土壤特異性HT DNA提取試劑盒，但這些試劑盒尚未在不同的土壤類型上進行獨立測試。作者選取了三種不同的DNA提取試劑盒做測試，提取DNA并提出了一個完整的高通量工作流程，從DNA提取到小型化Illumina擴增子或宏基因組文庫。

圖1 實驗設計

頂部：實驗設計。采用五種不同的土壤類型對三種不同的HT DNA提取方法進行了基準測試。通過DNA提取的質量、數量、長度和觀察群落特征來評價DNA提取效果。I. DOT one隨后被用于小型化宏基因組和擴增子。底部：從DNA提取到宏基因組或擴增子的每一步的實際操作時間、總時間和成本。時間反映了一個96孔板的處理時間，成本為每個樣品的計算。對于宏基因組和擴增子，兩個96孔板可以同時處理，只增加少量的總時間。

圖2 標準和小型擴增子的群落特征比較

(A)按土壤類型分面，在屬水平上跨反應體積的群落剖面熱圖。(B) ASV的差異相對豐度圖。(C) Hellinger轉化相對豐度，PCA。過濾掉至少一個樣品中相對豐度不超過0.1%的asv。

在屬水平上，標準擴增子文庫和小型化擴增子文庫之間的群落概況相似(圖2A)。在對標準方案和小型化方案之間的所有ASV進行差異豐度分析時，發現共有19個ASV存在差異豐度(圖2B)。僅使用相對豐度高于0.1 %的ASV，不同文庫制備方案所解釋的方差占觀察到的總方差的0.9%（PERMANOVA，p=0.03）（圖3C）。

小型化方案有效地將擴增文庫制備的化學和塑料成本從4.9美元降低到3.6美元。

圖 3

(A)按土壤類型分面的屬級反應體積群落剖面熱圖。(B)各屬的差異豐度圖(C) Hellinger轉化相對豐度，PCA。在至少一個樣品中相對豐度不超過0.1%的屬被過濾掉。

在屬水平上的相對豐度比較顯示，無論土壤類型如何，標準方案和小型化方案之間的剖面非常相似(圖3A)。沒有發現鑒定的屬在不同的方案之間差異豐富(圖3B)。僅使用相對豐度大于0.1%的屬，差異可以由不同的文庫制備方案解釋占觀察到的總方差的0.3% (PERMANOVA, p=0.21)(圖3C)。

作為方案優化步驟的一部分，測試了不同比例的樣品純化珠(SPB/IPB)以獲得最佳片段大小分布，因為小型化方案觀察到片段向較短片段的轉變。將Illumina DNA文庫制備小型化10倍，將我們制備宏基因組的化學和塑料成本從52.2美元降低到7.3美元。