癌癥干細(xì)胞假說(shuō)認(rèn)為，腫瘤由一小群表現(xiàn)出干細(xì)胞特性的細(xì)胞驅(qū)動(dòng)和維持。研究人員依賴于腫瘤球形成實(shí)驗(yàn)來(lái)識(shí)別和擴(kuò)增這些癌癥干細(xì)胞[1]。腫瘤球是來(lái)自癌癥干細(xì)胞的固態(tài)球形細(xì)胞形成，不是由其他來(lái)源的細(xì)胞聚集而成。這些細(xì)胞可在無(wú)血清、非粘附條件下生長(zhǎng)，并且可以在體外用于表征癌癥干細(xì)胞群體[2]。
MCF-7是一種模型乳腺癌研究細(xì)胞系，用于乳腺球測(cè)定，用CD44和CD24等標(biāo)記物檢測(cè)癌癥干細(xì)胞特性。乳腺球發(fā)育的關(guān)鍵步驟是分離單細(xì)胞，然后計(jì)算成球效率(SFE)[3]。在傳統(tǒng)的腫瘤球形成實(shí)驗(yàn)中，細(xì)胞的接種密度通常在每毫升1,000到100,000個(gè)細(xì)胞之間變化，而不是僅從干細(xì)胞中生長(zhǎng)，這可能導(dǎo)致細(xì)胞聚集而非真正的腫瘤球形成[4,5]。為了提高腫瘤球的單細(xì)胞起源比例，理想的接種方式是每個(gè)孔中只接種一個(gè)細(xì)胞。然而，這在技術(shù)上是一個(gè)挑戰(zhàn)，因?yàn)樾枰_地分離和放置單個(gè)細(xì)胞，同時(shí)避免細(xì)胞損傷。
WOLF G2單細(xì)胞柔性分選系統(tǒng)
單細(xì)胞分選的創(chuàng)新應(yīng)用
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NanoCellect Biomedical, Inc. 推出的WOLF G2單細(xì)胞柔性分選系統(tǒng)，通過(guò)其N1 Single Cell Dispenser，能夠通過(guò)分離具有特定標(biāo)記的細(xì)胞，高效地獲取癌癥干細(xì)胞，并通過(guò)在每個(gè)孔中精確沉積單個(gè)相關(guān)細(xì)胞來(lái)提高腫瘤球形成效率。
MCF-7 (ATCC HTB-22)細(xì)胞在T75瓶中生長(zhǎng)，培養(yǎng)基由DMEM、10%FBS及1% antibiotic-antimycotic組成。使用0.05%胰蛋白酶-EDTA制備成單細(xì)胞懸浮液，與4℃保存。MCF-7細(xì)胞和SpectraComp補(bǔ)償Beads用PE小鼠抗人CD24和FITC小鼠抗人CD44染色，在細(xì)胞染色之前，用Human TruStain FcX-FC受體阻斷液阻斷MCF-7細(xì)胞10分鐘，然后用抗體染色。使用DRAQ7 (Invitrogen #D15107)作為活性染料，從分類中排除死細(xì)胞。
使用補(bǔ)償Beads創(chuàng)建補(bǔ)償矩陣以校正熒光通道溢出，使用單染色對(duì)照設(shè)置適當(dāng)?shù)拈T以從表達(dá)CD44high/CD24low的群體中進(jìn)行分類(圖1)。使用WOLF G2對(duì)MCF-7細(xì)胞以1 x10^5細(xì)胞/mL的濃度進(jìn)行分選，并將單個(gè)細(xì)胞分選至預(yù)先填充有200 μL完全克隆介質(zhì)的96孔超低附著板中，完全克隆介質(zhì)由MammoCult Human Medium Kit組成，補(bǔ)充有4 μg/mL肝素和0.48 μg/mL氫化可的松。分選后，板子在37°C和5% CO2條件下孵育前，以100 x g離心3分鐘。
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圖1. 從MCF-7細(xì)胞中篩選乳腺球生成細(xì)胞的圈門策略：對(duì)腫瘤干細(xì)胞標(biāo)記CD44high/ CD24low的人群進(jìn)行分類需要適當(dāng)?shù)?/strong>圈門。A.創(chuàng)建了一個(gè)樣品門，以排除碎片，B.緊接著圈單細(xì)胞門以排除雙細(xì)胞，C.將單細(xì)胞門應(yīng)用于死活圖以排除死細(xì)胞，然后將其應(yīng)用于CD44-FITC和CD24-PE 的雙變量圖，D.從雙變量圖中，制作一個(gè)包含CD44high/CD24low細(xì)胞的門來(lái)進(jìn)行排序，在藍(lán)色門中突出顯示。
作為對(duì)照，使用額外的單細(xì)胞盒將10個(gè)細(xì)胞/孔沉積，以復(fù)制當(dāng)前技術(shù)。細(xì)胞沉積在預(yù)先填充有200 μL克隆介質(zhì)的96孔板上，隨后在37°C和5% CO2條件下孵育前，以100 x g離心3分鐘。
在第0天、第4天和第7天觀察板子，并在第4天更換介質(zhì)，即去除100 μL的廢介質(zhì)并補(bǔ)充100 μL新鮮克隆介質(zhì)。使用相差顯微鏡（ECHO Revolve）在10倍放大下追蹤沉積細(xì)胞的生長(zhǎng)。此外，使用5 μM的Calcein AM和25 μg/mL的碘化丙啶（PI）對(duì)球體進(jìn)行染色，并使用FITC和TRITC濾光片（ECHO Revolve）在10倍放大下進(jìn)行可視化。
在第7天手動(dòng)計(jì)數(shù)每個(gè)孔中的乳腺球數(shù)量，并與第0天沉積的細(xì)胞數(shù)量進(jìn)行比較，以找出起源于單個(gè)細(xì)胞的乳腺球。將此數(shù)量除以板上的孔總數(shù)，以確定SFE。使用1個(gè)細(xì)胞/孔和10個(gè)細(xì)胞/孔制備的板子來(lái)計(jì)算和比較此值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次以確保結(jié)果的可靠性和重復(fù)性。
1、顯微鏡分析顯示，WOLF G2分選的細(xì)胞形成的腫瘤球在第7天平均直徑為42.9 ± 13.2 μm，并且觀察到從第0天、第3天以及第7天的生長(zhǎng)（圖2）。第7天的腫瘤球用Calcein AM和碘化丙啶（PI）染色，以可視化活細(xì)胞和死細(xì)胞。低細(xì)胞密度的板顯示出核心區(qū)域PI染色較少（圖3A），而10個(gè)細(xì)胞/孔的接種顯示出更多死細(xì)胞區(qū)域（圖3B）。
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圖2. 從兩個(gè)不同的孔中生長(zhǎng)的腫瘤球體的代表性圖像:在第0、4和7天用10倍放大鏡分析乳腺球體。第0天用于確認(rèn)單細(xì)胞沉積，隨后的幾天用于測(cè)量整個(gè)過(guò)程的生長(zhǎng)情況。每隔一天更換一次克隆培養(yǎng)基，以滿足球體生長(zhǎng)。到第7天，球的平均直徑為42.9 ± 13.2 μm。比例尺，200 μm。
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圖3. 第 7 天染色腫瘤球體的代表圖像：用熒光顯微鏡觀察Calcein AM（綠色）和PI（紅色）染色的腫瘤球。A. 源自單個(gè)細(xì)胞的球體顯示出明顯的中心，死細(xì)胞被可繼續(xù)增殖的靜止細(xì)胞包圍。B. 然而，源自10個(gè)細(xì)胞/孔的球體顯示出更多的死亡細(xì)胞，增殖邊緣較少。
2、使用WOLF G2進(jìn)行的單細(xì)胞分選結(jié)果顯示，第0天只有9.2 ± 2.8%的孔為空，1.5 ± 0.4%的孔含有兩個(gè)或更多細(xì)胞。到第7天，平均有82.1 ± 2.7%的孔含有腫瘤球，其中80.7 ± 2.7%的腫瘤球起源于單個(gè)細(xì)胞（圖4）。
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圖4. 單細(xì)胞克隆第0天單孔細(xì)胞數(shù)和第7天腫瘤球生長(zhǎng)情況:第0天單孔細(xì)胞數(shù)平均為89.3 ± 2.9%，第7天單孔細(xì)胞繼續(xù)生長(zhǎng)的平均為80.7 ± 2.7%。
3、第0天1個(gè)細(xì)胞/孔的腫瘤球的數(shù)量是10個(gè)細(xì)胞/孔的4倍(圖5)。這增加了下游應(yīng)用所需的起始腫瘤球數(shù)量。
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圖5. 1個(gè)細(xì)胞/孔和10個(gè)細(xì)胞/孔時(shí)的球體形成效率：與10個(gè)細(xì)胞/孔相比，1個(gè)細(xì)胞/孔沉積時(shí)的球形形成效率更高，是10個(gè)細(xì)胞/孔的4倍。
WOLF G2單細(xì)胞柔性分選系統(tǒng)可以支持免疫腫瘤學(xué)和藥物篩選平臺(tái)，對(duì)進(jìn)行腫瘤球測(cè)定以進(jìn)一步研究癌癥起到了重要作用。本研究中，WOLF G2單細(xì)胞柔性分選系統(tǒng)展示了其在增加每個(gè)96孔板的腫瘤球數(shù)量方面的效率，由于其能夠隔離特定的目標(biāo)群體并溫和地分選它們，從而提高了單細(xì)胞克隆性。
