杯狀細(xì)胞作為腸道黏液屏障的核心細(xì)胞，其黏液分泌依賴未折疊蛋白反應(yīng)（UPR）傳感器IRE1β的精準(zhǔn)調(diào)控——IRE1β通過RIDD機(jī)制調(diào)控MUC2黏液的合成與分泌[1,2]，但其活性如何適配黏液折疊負(fù)荷一直是未解之謎。AGR2作為杯狀細(xì)胞特異性二硫鍵異構(gòu)酶，其功能異常與炎癥性腸病（IBD）密切相關(guān)，但此前未發(fā)現(xiàn)其與UPR通路的關(guān)聯(lián)[3,4]。本研究通過高通量實(shí)驗(yàn)技術(shù)與分子機(jī)制驗(yàn)證，揭示AGR2作為IRE1β的特異性調(diào)控因子，通過破壞其dimer形成抑制核酸酶活性，且疾病相關(guān)突變會喪失該調(diào)控功能。其中，I.DOT非接觸式納升級移液系統(tǒng)為高通量RT-qPCR定量提供了精準(zhǔn)支撐，助力快速驗(yàn)證分子互作與信號通路變化，為理解杯狀細(xì)胞穩(wěn)態(tài)失衡與IBD的關(guān)聯(lián)提供了全新視角。
構(gòu)建IRE1α敲除（ERN1?/?）的Calu-1（非杯狀細(xì)胞）和LS174T（杯狀細(xì)胞樣）細(xì)胞系（CRISPR-Cas9技術(shù)，F(xiàn)igure 1B），通過慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)建立多西環(huán)素誘導(dǎo)的IRE1β-FLAG表達(dá)系統(tǒng)，以及AGR2及其突變體（C81S、H117Y等）的穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系。選取野生型與Agr2?/?小鼠結(jié)腸組織用于體內(nèi)驗(yàn)證（Figure 2E）。
圖1. IRE1β活性在杯狀細(xì)胞中過表達(dá)時減弱。A圖，RT-qPCR分析ERN2IRE1β在人細(xì)胞系中的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。對培養(yǎng)物進(jìn)行三次取樣，發(fā)現(xiàn)ERN2的表達(dá)與LS174T親本細(xì)胞中的表達(dá)有關(guān)。用于進(jìn)一步研究的細(xì)胞系示意圖。首先，利用CRISPR/Cas9建立了LS174T和CALU-1親本的ERN1-/-克隆。然后，用Teton模塊轉(zhuǎn)導(dǎo)ERN1-/-細(xì)胞表達(dá)多西環(huán)素調(diào)控的β-FLAG。C圖顯示了過度表達(dá)IRE1β-FLAG的培養(yǎng)物的表型。左圖顯示未經(jīng)處理的培養(yǎng)物，中圖顯示接受1μg/ml多西環(huán)素作用72小時的培養(yǎng)物(從而表達(dá)IRE1β-FLAG)，右圖顯示接受1μg/ml多西環(huán)素和1μM IRE1核酸內(nèi)切酶抑制劑4μ8C的培養(yǎng)物。代表了三個獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)。D Western印跡驗(yàn)證(C)中使用的細(xì)胞系中的轉(zhuǎn)基因表達(dá)。收集轉(zhuǎn)基因誘導(dǎo)24小時后剩余的貼壁細(xì)胞，用免疫印跡法檢測FLAG-IRE1β的表達(dá)。以微管蛋白作為載藥對照。感染的多重性(MOI)表示添加的病毒顆粒的理論數(shù)量。E，F(xiàn) RT-qPCR分析轉(zhuǎn)基因誘導(dǎo)后24小時XBP1s/T(E)和BLOC1S1轉(zhuǎn)錄水平(F)。代表三個獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)，每個條件有三個重復(fù)。(E)下圖顯示XBP1在常規(guī)PCR檢測的同一樣本中的剪接。快速遷移帶為剪接XBP1轉(zhuǎn)錄本，慢遷移帶為XBP1非剪接轉(zhuǎn)錄本。
圖2. 粘蛋白伴侶agr2是ire1β的杯狀細(xì)胞特異性相互作用分子。A圖，B和C的MS分析樣本中標(biāo)志標(biāo)記IRE1的轉(zhuǎn)基因表達(dá)和免疫沉淀的成功驗(yàn)證用抗FLAG檢測IRE1-FLAG的表達(dá)，并以肌動蛋白作為負(fù)載對照。B圖為用于進(jìn)一步研究的細(xì)胞系示意圖。首先，利用CRISPR/Cas9建立了LS174T和CALU-1親本的ERN1-/-克隆。然后，用Teton模塊轉(zhuǎn)導(dǎo)ERN1-/-細(xì)胞表達(dá)多西環(huán)素調(diào)控的β-FLAG。C圖顯示了過度表達(dá)IRE1β-FLAG的培養(yǎng)物的表型。左圖顯示未經(jīng)處理的培養(yǎng)物，中圖顯示接受1μg/ml多西環(huán)素作用72小時的培養(yǎng)物(從而表達(dá)IRE1β-FLAG)，右圖顯示接受1μg/ml多西環(huán)素和1μM IRE1核酸內(nèi)切酶抑制劑4μ8C的培養(yǎng)物。代表了三個獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)。D圖的Western印跡驗(yàn)證(C)中使用的細(xì)胞系中的轉(zhuǎn)基因表達(dá)。收集轉(zhuǎn)基因誘導(dǎo)24小時后剩余的貼壁細(xì)胞，用免疫印跡法檢測FLAG-IRE1β的表達(dá)。以微管蛋白作為載藥對照。感染的多重性(MOI)表示添加的病毒顆粒的理論數(shù)量。E，F(xiàn) RT-qPCR分析轉(zhuǎn)基因誘導(dǎo)后24小時XBP1s/T(E)和BLOC1S1轉(zhuǎn)錄水平(F)。代表三個獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)，每個條件有三個重復(fù)。(E)下圖顯示XBP1在常規(guī)PCR檢測的同一樣本中的剪接。快速遷移帶為剪接XBP1轉(zhuǎn)錄本，慢遷移帶為XBP1非剪接轉(zhuǎn)錄本。
通過親和純化質(zhì)譜（AP-MS）篩選IRE1β相互作用蛋白（Figure 2A-C），Co-IP（含Avi-tag/FLAG標(biāo)簽系統(tǒng)）驗(yàn)證AGR2與IRE1β的特異性結(jié)合（Figure 2D-E、4E-F）；凝膠過濾層析分析IRE1β的寡聚化狀態(tài)（Figure 4B-C）；RT-qPCR定量XBP1剪接效率與RIDD靶基因（BLOC1S1）表達(dá)（重點(diǎn)：采用I.DOT完成384孔板的反應(yīng)混合液制備與樣品轉(zhuǎn)移，保障高通量定量的精準(zhǔn)性；AnnexinV/活死染色定量細(xì)胞死亡（Figure3C、5E）；AlphaFold2進(jìn)行AGR2-IRE1β相互作用結(jié)構(gòu)建模。
圖3. 共表達(dá)可抑制IRE1β的核酸內(nèi)切酶活性。A圖用1μg/ml多西環(huán)素誘導(dǎo)轉(zhuǎn)基因24小時后，進(jìn)行XBP1S/T和BLOC1S1轉(zhuǎn)錄水平的RT-qPCR分析。下圖顯示了XBP1在相同樣本中的剪接情況，這些樣本通過常規(guī)的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)檢測。代表三個獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)，每個條件有三個重復(fù)。B圖片顯示了過度表達(dá)IRE1agr2-FLAG和不表達(dá)β的培養(yǎng)物的表型。左側(cè)面板顯示未經(jīng)處理的培養(yǎng)物，中間面板顯示接受1μg/ml多西環(huán)素72小時的培養(yǎng)物，右側(cè)面板中的培養(yǎng)物接受1μg/ml多西環(huán)素和1μM 4μ8C。代表了三個獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)。48小時后，在加入和不加入外源β的情況下，對高表達(dá)IRE1AGR2-FLAG的細(xì)胞死亡進(jìn)行定量。培養(yǎng)皿中所有細(xì)胞經(jīng)AnnexinV和Live/Dead染色后進(jìn)行流式細(xì)胞儀分析。所有單陽性和雙陽性細(xì)胞均為死亡細(xì)胞。代表2個獨(dú)立實(shí)驗(yàn)，每個條件有三個重復(fù)。D分析IRE1、β-FLAG和AGR2在用于C的細(xì)胞系中的表達(dá)。僅收集仍附著在培養(yǎng)皿中的細(xì)胞，并用抗FLAG和抗AGR2來檢測IRE1β和AGR2的表達(dá)。以微管蛋白作為載藥對照。在LS174TERN1-/-IRE1FLAG-DOX細(xì)胞中驗(yàn)證agr2基因敲除效率。NTC是siRNA的非靶向控制池，# 1和 # 3是siRNA的靶向AGR2。4μ8C或DMSO(載體)部分擊倒和/或處理后XBP1剪接的變化。剪接顯示為NTC/Vehicle處理的細(xì)胞的log2倍變化。E和F代表三個獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)，每個條件有三個重復(fù)。G蛋白印跡確證(E)和(F)。72小時后提取蛋白質(zhì)，檢測XBP1s、AGR2和微管蛋白的表達(dá)。
圖4. Agr2通過破壞ire1β二聚體來阻斷β的活性。A圖為B和C的凝膠過濾實(shí)驗(yàn)的示意圖概述B在HEK293T裂解物的洗脫過程中測量到的msfGFP熒光，該裂解物在沒有agr2(黑點(diǎn)跡線)或存在agr2(橙色和紫色痕跡表示不同比例的轉(zhuǎn)基因agr2：ire1ββ)的情況下高表達(dá)ir1 DNA。最高標(biāo)度代表大致的洗脫圖譜和蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)的預(yù)期分子量。底圖顯示了基于蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)和先前獲得的洗脫圖譜(灰色)的預(yù)期齊聚狀態(tài)。實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了一次。在沒有或存在額外β表達(dá)的情況下，從CALU-1ERN1-/IRE1AGR1FLAG-DOX細(xì)胞的蛋白裂解物凝膠過濾后收集的組分中c IRE1AGR2-FLAG的表達(dá)。折線圖顯示了凝膠中的帶強(qiáng)度的量化。代表了兩個獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)。E和F中競爭IP實(shí)驗(yàn)的D示意圖。IRE1β用等摩爾量的Avittag或FLAG標(biāo)記表示。在被Bira生物素化后，如果已經(jīng)形成二聚體，則在鏈霉親和素IP之后將同時檢測到avi標(biāo)簽和FLAG標(biāo)簽。如果添加另一種蛋白質(zhì)(例如AGR2)會阻止這一過程，預(yù)計會失去信號。E競爭IP顯示AGR2共表達(dá)時二聚體形成丟失。標(biāo)本用抗AGR2、抗FLAG和鏈霉親和素免疫印跡。在輸入樣品中使用微管蛋白作為加載對照。代表了兩個獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)。F競爭IP表明，隨著AGR2共表達(dá)的增加，二聚體的形成隨濃度的增加而喪失。標(biāo)本用抗AGR2、抗FLAG和鏈霉親和素免疫印跡。在輸入樣品中使用微管蛋白作為加載對照。代表了兩個獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)。
圖5. AGR2中催化死亡的C81S和致病的H117Y突變使其失去了結(jié)合和抑制IRE1β活性的能力。A圖，在PyMol中顯示了AGR2(PDB：2LNS)的結(jié)構(gòu)，并指出了相關(guān)的突變。紫色和灰色的卡通描繪了兩個AGR2分子及其二聚體結(jié)構(gòu)38，特定的殘基用球棒表示。B使用AGR2突變體的競爭IP示意圖概述。C競爭IP顯示C81S和H117Y AGR2突變體對二聚體的抑制作用喪失。用抗agr2、抗FLAG-IRE1β和鏈霉親和素免疫印跡標(biāo)本。在輸入樣品中使用微管蛋白作為加載對照。代表了兩個獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)。D CALU-1ERN1-/-IRE1βFLAG-DOX細(xì)胞經(jīng)構(gòu)建的β基因(野生型或突變體)導(dǎo)入后，經(jīng)1μg/ml多西環(huán)素誘導(dǎo)72小時后，IRE1AGR2FLAG-DOX過表達(dá)。對轉(zhuǎn)基因表達(dá)72小時后D細(xì)胞系的細(xì)胞死亡進(jìn)行量化。培養(yǎng)皿中所有細(xì)胞經(jīng)Annexin V和Live/Dead染色后進(jìn)行流式細(xì)胞儀分析。所有單陽性細(xì)胞和雙陽性細(xì)胞均為死亡細(xì)胞。代表兩個獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)，有兩個重復(fù)。
在RT-qPCR實(shí)驗(yàn)中，I.DOT非接觸式納升級移液系統(tǒng)用于將cDNA、引物、SYBR混合液精準(zhǔn)轉(zhuǎn)移至384孔板，每孔反應(yīng)體積均一（納升級），避免交叉污染，顯著提升定量準(zhǔn)確性與實(shí)驗(yàn)通量，為IRE1β活性相關(guān)基因表達(dá)的高通量驗(yàn)證提供技術(shù)支撐（對應(yīng)Figure 1E-F、3A、3F）
非杯狀細(xì)胞（Calu-1）中過表達(dá)IRE1β會引發(fā)劇烈細(xì)胞死亡與XBP1剪接（Figure 1C-E），而杯狀細(xì)胞樣LS174T中IRE1β活性顯著降低（Figure 1C、1E）。AP-MS與Co-IP驗(yàn)證顯示，AGR2與IRE1β特異性結(jié)合，不與IRE1α互作，且體內(nèi)小鼠結(jié)腸組織中也存在該相互作用（Figure 2B-E），提示AGR2是IRE1β的杯狀細(xì)胞特異性調(diào)控因子。
Calu-1細(xì)胞中共表達(dá)AGR2可顯著降低IRE1β介導(dǎo)的XBP1剪接與RIDD活性（Figure 3A），并完全逆轉(zhuǎn)其細(xì)胞毒性（Figure 3B-C）；反之，LS174T細(xì)胞中siRNA敲低AGR2會增強(qiáng)IRE1β活性（Figure 3E-G），且IRE1β抑制劑4μ8C可逆轉(zhuǎn)該效應(yīng)，證明AGR2直接抑制IRE1β功能。
凝膠過濾層析顯示，AGR2共表達(dá)會使IRE1β的二聚體峰向單體峰偏移（Figure 4B-C）；競爭Co-IP實(shí)驗(yàn)表明，AGR2劑量依賴性破壞IRE1β-Avi與IRE1β-FLAG的二聚體形成（Figure 4E-F），直接證明AGR2通過阻止IRE1β二聚化使其失活。
AGR2的催化死突變C81S（喪失二硫鍵異構(gòu)酶活性）與IBD相關(guān)突變H117Y，均無法與IRE1β結(jié)合，也不能破壞其dimer或抑制細(xì)胞毒性（Figure 5C-E）；而單體突變體（E60A、K64A）仍保留調(diào)控功能，說明AGR2的催化結(jié)構(gòu)域與H117位點(diǎn)是結(jié)合IRE1β的關(guān)鍵，與二聚化能力無關(guān)。
本研究的核心突破在于揭示了AGR2作為IRE1β的“分子變阻器”，通過杯狀細(xì)胞特異性表達(dá)精準(zhǔn)調(diào)控IRE1β的核酸酶活性，進(jìn)而平衡黏液折疊負(fù)荷與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（ER）穩(wěn)態(tài)。這一發(fā)現(xiàn)的核心價值體現(xiàn)在三方面：從機(jī)制創(chuàng)新來看，首次證實(shí)AGR2可通過直接結(jié)合IRE1β的柔性環(huán)區(qū)域，破壞其二聚體形成，從而抑制IRE1β的XBP1剪接與RIDD活性，填補(bǔ)了IRE1β特異性調(diào)控機(jī)制的空白，且與BIP調(diào)控IRE1α的模式形成鮮明的旁系同源物（paralogue）特異性調(diào)控網(wǎng)絡(luò)；從疾病關(guān)聯(lián)來看，炎癥性腸病（IBD）相關(guān)的AGR2H117Y突變會導(dǎo)致其喪失對IRE1β的調(diào)控功能，引發(fā)IRE1β過度激活，這可能是杯狀細(xì)胞功能異常與腸道炎癥的關(guān)鍵誘因，為IBD精準(zhǔn)治療提供了全新靶點(diǎn)；從技術(shù)支撐來看，I.DOT非接觸式納升級移液系統(tǒng)在RT-qPCR中的應(yīng)用，保障了384孔板高通量基因定量的準(zhǔn)確性與重復(fù)性，尤其是納升級體積的精準(zhǔn)分配，不僅減少了樣品損耗與交叉污染，還為分子機(jī)制的快速驗(yàn)證（如XBP1剪接效率、靶基因表達(dá)定量）提供了高效工具，助力高通量篩選與機(jī)制驗(yàn)證的無縫銜接。
未來研究可進(jìn)一步深入探索AGR2與IRE1β的結(jié)合動力學(xué)特征，以及黏液折疊負(fù)荷如何通過調(diào)控二者相互作用影響IRE1β活性；同時，基于本研究揭示的調(diào)控機(jī)制，開發(fā)靶向AGR2-IRE1β軸的小分子藥物，有望為IBD等黏液屏障相關(guān)疾病提供新的治療策略。此外，I.DOT在本研究中的成功應(yīng)用，也為類似分子機(jī)制研究提供了可復(fù)用的技術(shù)范式，將進(jìn)一步推動未折疊蛋白反應(yīng)（UPR）通路調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的系統(tǒng)解析，為理解更多分泌細(xì)胞的穩(wěn)態(tài)調(diào)控機(jī)制奠定基礎(chǔ)。
同騰睿杰（上海）生物技術(shù)有限公司作為CYTENA I.DOT中國總代理商，為您提供優(yōu)質(zhì)的售前售后服務(wù)。
聯(lián)系電話：021-50826962
聯(lián)系郵箱：sales@ttbiotech.com
1、Tschurtschenthaler, M. et al. Defective ATG16L1-mediated removal of IRE1alpha drives Crohn's disease-like ileitis. The Journal of experimental medicine 214, 401-422.
2、Tsuru, A. et al. Negative feedback by IRE1beta optimizes mucin production in goblet cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 110, 2864-2869.
3、Al-Shaibi, A. A. et al. Human AGR2 Deficiency Causes Mucus Barrier Dysfunction and Infantile Inflammatory Bowel Disease. Cellular and molecular gastroenterology and hepatology 12, 1809-1830.
4、Bertoli-Avella, A. et al. A disorder clinically resembling cystic fibrosis caused by biallelic variants in the AGR2 gene. Journal of medical genetics 59, 993-1001.
