細(xì)胞因子TNF-α（TNF-α）在亞nM濃度下容易形成同源三聚體以促進(jìn)炎癥。為了治療TNF-α水平上調(diào)的炎性疾病，目前使用許多治療性抗體作為清除劑以降低患者中的活性TNF-α濃度。盡管它們的臨床成功，不同抗體形式在穩(wěn)定三聚體狀態(tài)方面的作用模式尚未完全了解。在這里，我們使用具有動(dòng)態(tài)納米桿的生物傳感器來(lái)分析TNF-α的單體和三聚體狀態(tài)以及治療性生物制劑的結(jié)合動(dòng)力學(xué)。1.7 × 10^?3 s^?1可以直接使用heliX系統(tǒng)測(cè)量，并在pM范圍內(nèi)分析抗體結(jié)合親和力。阿達(dá)木單抗、英夫利昔單抗、依那西普、賽妥珠單抗、戈利木單抗的二價(jià)和單價(jià)結(jié)合形式的三聚體穩(wěn)定效應(yīng)被量化。觀察到三聚體穩(wěn)定性的明顯差異，這可能為深入了解TNF-α清除劑的作用模式提供了更深入的見(jiàn)解

TNFTNF-α是一個(gè)細(xì)胞因子，在介導(dǎo)炎癥過(guò)程中起著關(guān)鍵作用.TNF-α的單體亞單位在溶液中以亞納摩爾濃度形成穩(wěn)定的非共價(jià)同源三聚體。內(nèi)源性TNF受體（TNFR）1和2通過(guò)識(shí)別TNF-α三聚體進(jìn)行信號(hào)傳遞，TNFR 1和2在與TNF-α形成復(fù)合物之前形成三聚體。已知三聚體TNF-α在低濃度下隨時(shí)間單體化。其導(dǎo)致生物活性的喪失。在患有多種不同自身免疫性疾病的患者中發(fā)現(xiàn)TNF-α表達(dá)水平升高.抗TNF-α的清除性抗體和抗原結(jié)合片段（Fab）已被證明能成功抑制TNF-α的表達(dá)。包括類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、銀屑病和克羅恩病在內(nèi)的炎性自身免疫疾病中介導(dǎo)的炎癥。

盡管治療性抗體形式之間存在顯著的結(jié)構(gòu)差異：英夫利西單抗、阿達(dá)木單抗、塞妥珠單抗和依那西普，研究表明，所有四種生物分子均通過(guò)與人細(xì)胞上的膜結(jié)合TNF-α結(jié)合參與反向信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，盡管依那西普和塞妥珠單抗不能交聯(lián)任何類型的TNF-α三聚體.阿達(dá)木單抗Fab和英夫利西單抗Fab與單個(gè)TNF-α三聚體的多個(gè)結(jié)合事件的結(jié)構(gòu)差異表明，TNF三聚體與阿達(dá)木單抗Fab復(fù)合物的穩(wěn)定性更強(qiáng)，其結(jié)合在兩個(gè)單體亞單位之間的界面上，而每個(gè)英夫利西單抗Fab與TNF-α三聚體中的單個(gè)單體亞單位結(jié)合。交聯(lián)似乎與誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡無(wú)關(guān)，因?yàn)轶w外試驗(yàn)顯示，對(duì)于英夫利西單抗，F(xiàn)ab和完整IgG之間沒(méi)有顯著差異。利用分子排阻色譜法（SEC）進(jìn)行的試驗(yàn)可以顯示，二價(jià)TNF-α結(jié)合劑（如阿達(dá)木單抗、英夫利西單抗和戈利木單抗）能夠形成由三個(gè)IgG分子連接的三種可溶性TNF-α三聚體的高度穩(wěn)定復(fù)合物。關(guān)于TNF-α清除劑在TNF-α寡聚體狀態(tài)下的行為，我們知之甚少。

在這項(xiàng)研究中，研究人員對(duì)TNF-a單聚化和重三聚化的實(shí)時(shí)動(dòng)力學(xué)進(jìn)行研究。之前的研究重點(diǎn)關(guān)注平衡狀態(tài)下的單體交換率，采用F?rster共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）以及分析性尺寸排阻層析分析。與這些研究相反，我們使用新型電可切換生物表面技術(shù)（ESB）通過(guò)實(shí)時(shí)連續(xù)測(cè)量來(lái)確定通用單體化率。由于與其清除劑復(fù)合時(shí)，TNF-a的單聚化反映了自由TNF-a的增加，因此我們研究了TNF-a-三聚體-TNF-cleaner復(fù)合物與阿達(dá)木單抗、英夫利西單抗、戈利木單抗、塞托珠單抗和依那西普以及源自阿達(dá)木單抗、英夫利西單抗和戈利木單抗的Fab片段的穩(wěn)定性。我們發(fā)現(xiàn)TNF-a可以在活性三聚體和非活性單體之間快速切換，這揭示了一種新的、快速作用的方式來(lái)調(diào)節(jié)其生物活性。有趣的是，治療性抗體形式及其Fabs的三聚體穩(wěn)定性存在很大差異。有些不會(huì)（完全）抑制結(jié)合的TNF-a的單體化，從而導(dǎo)致TNF-a單體的釋放。這些TNF-a的單體亞基尚未顯示形成臨床相關(guān)量的三聚體TNF-a。然而，在體外實(shí)驗(yàn)中，已經(jīng)證明了濃度依賴性的重三聚化。

為了評(píng)估TNF-α的寡聚狀態(tài)，將蛋白質(zhì)以500 nM的濃度固定到傳感器表面，該濃度顯著高于亞納摩爾三聚KD以避免單體化。在誘導(dǎo)單體化之前，在四個(gè)重復(fù)中測(cè)定固定化TNF-α的大小，得到初始狀態(tài)的流體動(dòng)力學(xué)直徑為5.6± 0.1 nm（圖1B，t0）。該值與基于TNF-α三聚體PDB結(jié)構(gòu)的流體動(dòng)力學(xué)直徑的計(jì)算預(yù)測(cè)非常一致，其產(chǎn)生的DH值為5.76 nm（3ALQ）至6.10 nm（1 TNF）。接著，通過(guò)以1 ml/min的流速注射運(yùn)行緩沖液2000 s，引發(fā)固定化TNF-α的單體化，由于TNF-α亞基的解離，導(dǎo)致轉(zhuǎn)換速度逐漸增加（流體動(dòng)力學(xué)摩擦降低）（圖1C）。與之前報(bào)道的三聚體TNF-a之間在小時(shí)范圍內(nèi)緩慢的單體交換相反，發(fā)現(xiàn)純單體化在30分鐘內(nèi)發(fā)生，產(chǎn)生單體化率k=1.66±0.25 10^{- 3}s^-1。緩沖液流動(dòng)后，通過(guò)測(cè)定單體TNF-a的流體動(dòng)力學(xué)直徑來(lái)評(píng)價(jià)單體化效率，所得DH為3.5至4.0納米（t1，圖1B）。再次，發(fā)現(xiàn)該值與基于單體TNF-a的DBC結(jié)構(gòu)的計(jì)算預(yù)測(cè)（4.39納米，4G3Y; 4.44納米，3WD5）非常一致。這表明在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，實(shí)現(xiàn)了完全的單體化。

圖1. TNF-a的單體化和再三聚動(dòng)力學(xué)。通過(guò)與表面束縛的互補(bǔ)DNA鏈雜交來(lái)固定化TNF-a-DNA結(jié)合物，通過(guò)緩沖液流進(jìn)行單體化，然后重新三聚化（A）。通過(guò)測(cè)量流體動(dòng)力學(xué)直徑，確定固定化的TNF-a（t0）、單體化復(fù)合物（t1）和與納摩爾濃度的自由TNF-a作用的復(fù)合物（tEnd）的尺寸（B）。在初始狀態(tài)下，固定化的TNF-a的尺寸確定產(chǎn)生5.6±0.1nm的流體動(dòng)力學(xué)直徑，而在緩沖液流動(dòng)2000 s后，確定較小的尺寸，對(duì)應(yīng)于3.9±0.1nm的單體TNF-a。注射更高納摩爾濃度的自由TNF-a可誘導(dǎo)有效的三聚體形成，使轉(zhuǎn)變成為一個(gè)可逆的過(guò)程。單體化動(dòng)力學(xué)的單指數(shù)模擬得到的單體化速率為1.66±0.25 E-3 s-1（C，橙色實(shí)心線，t0至t1）。高納摩爾濃度的自由TNF-a導(dǎo)致在不到600 s內(nèi)快速重新三聚化（C，t1至tEnd）。

將固定化的單體TNF-a置于不同濃度的自由TNF-a中，以解析三聚動(dòng)力學(xué)（圖2）。1C，tl-tEnd）。正如之前報(bào)道的那樣，TNF-a的單體化和三聚化是一個(gè)完全可逆的過(guò)程。在這里，發(fā)現(xiàn)三聚體形成的開(kāi)始發(fā)生在約10 ns的自由TNF-a（175 ng/ml，圖1B、C）下。這些發(fā)現(xiàn)與使用基于FRET的分析的三聚體穩(wěn)定性評(píng)估一致，顯示在平衡條件下，濃度高達(dá)300 ng/ ml時(shí)三聚體狀態(tài)略有損失。當(dāng)濃度高于200 ns（3.5 μg/ml）時(shí)，可以在幾分鐘內(nèi)重新獲得完整的三聚體（圖1B、C、t1-tEnd）。這些實(shí)驗(yàn)中確定的TNF-a單聚和三聚的時(shí)間表比之前報(bào)道的文獻(xiàn)短得多。這可能反映了對(duì)促炎癥觸發(fā)物通常快速進(jìn)行的反應(yīng)。

在分析了TNF-a單體化的動(dòng)態(tài)性質(zhì)后，我們研究了TNF-a的低聚狀態(tài)對(duì)最常見(jiàn)的針對(duì)TNF-a的治療性抗體（即阿達(dá)木單抗）動(dòng)力學(xué)的影響。為了降低這種相互作用的復(fù)雜性，我們通過(guò)用木瓜蛋白酶進(jìn)行有限的蛋白酶切割來(lái)制備阿達(dá)木單抗的Fab片段，以創(chuàng)建一種簡(jiǎn)化的環(huán)境，其中至少一種相互作用伴侶（此處為阿達(dá)木單抗Fab）是單價(jià)的。為了簡(jiǎn)化分析，文獻(xiàn)中通常通過(guò)固定抗體來(lái)避免親合力（和交叉）效應(yīng)。然而，對(duì)于這個(gè)生物系統(tǒng)來(lái)說(shuō)，多價(jià)結(jié)合不容忽視，但解決它至關(guān)重要（見(jiàn)示意圖、圖。2和3）。

圖2. TNF-a-阿達(dá)木單抗Fab相互作用。以反向（固定化的TNF-a，A）和正向試驗(yàn)方向（固定化的Fab片段，B）記錄了TNF-a與阿達(dá)木單抗Fab的相互作用。注射在運(yùn)行緩沖液（1、2、4、8 ns）中稀釋的阿達(dá)木單抗Fab（A）或TNF-a（B）溶液260秒（結(jié)合），然后注射運(yùn)行緩沖液18，000秒（分離）。純淺灰色至黑線（1至8 Mb）代表標(biāo)準(zhǔn)化數(shù)據(jù)。橙色實(shí)線代表全球貼合數(shù)據(jù)。表1列出了動(dòng)態(tài)率、親和力和幅度。

首先，我們研究了單價(jià)阿達(dá)木單抗Fab在兩個(gè)方向上與三聚體TNF-a結(jié)合的更簡(jiǎn)單情況。在相反的試驗(yàn)方向中，阿達(dá)木單抗Fab與固定化三聚體TNF-a的結(jié)合動(dòng)力學(xué)（圖2A）可以通過(guò)單指數(shù)函數(shù)描述。與固定配體的每個(gè)結(jié)合事件都是獨(dú)立檢測(cè)的，這對(duì)應(yīng)于1：1的相互作用。Fabs從部分飽和表面（注射1和2 nM Fab）的分解動(dòng)力學(xué)是雙相的，具有快速和緩慢的速度，分別為kFast=1.42±0.39 10^{- 3}s^-1和kSLOW =8.52±0.28 10^{- 5}s^-1（圖2A和S3）。快速的分離率類似于之前確定的TNF-a單聚化率，并且很可能源于未被結(jié)合的Fab穩(wěn)定的TNF-a三聚體的衰變。緩慢的速度可以歸因于Fab與固定化的TNF-a三聚體的分離，這可以通過(guò)與圖*中相反的檢測(cè)方向進(jìn)行比較來(lái)看出。在這里，發(fā)現(xiàn)了與固定化阿達(dá)木單抗Fab的分離率相同的速率。正如預(yù)期的那樣，沒(méi)有觀察到快速單體化。相反，可觀察到的動(dòng)力學(xué)表明第三個(gè)甚至更慢的分解過(guò)程，這是可感知的，因?yàn)樾盘?hào)在18，000秒的運(yùn)行時(shí)間內(nèi)沒(méi)有接近基線。這可以用親合效應(yīng)來(lái)解釋，即兩個(gè)或三個(gè)固定的阿達(dá)木單抗Fab通過(guò)一個(gè)緊密結(jié)合的三聚體TNF-a相互連接。已知固定阿達(dá)木單抗Fab的多價(jià)結(jié)合形成高度穩(wěn)定的復(fù)合物。

然后，我們研究了完整阿達(dá)木單抗Iggs的親和力對(duì)與TNF-a相互作用的影響。之前的研究描述了三個(gè)阿達(dá)木單抗分子與三個(gè)TNF-a三聚體結(jié)合形成的高度穩(wěn)定的復(fù)合物。然而，這些復(fù)合物對(duì)相互作用參數(shù)的影響以及在其中一個(gè)分子被固定的情況下是否形成這些復(fù)合物是這里研究的主題。在兩種試驗(yàn)方向中，由于TNF-a和阿達(dá)木單抗IgGs固有的多價(jià)特性，可能發(fā)生多重結(jié)合（圖3A、B）。阿達(dá)木單抗全抗體和TNF-a的相互作用測(cè)量結(jié)果顯示，兩個(gè)方向上的速率常數(shù)相當(dāng)（表1）。此外，與上圖*中的親力相容性試驗(yàn)設(shè)置類似，阿達(dá)木單抗的兩個(gè)方向均表現(xiàn)出降低的分離幅度，表明形成了相互關(guān)聯(lián)的復(fù)合物。

表1列出了確定的TNF-a和阿達(dá)木單抗Fab/完整阿達(dá)木單抗抗體之間相互作用的動(dòng)力學(xué)速率和親和力。溶液中固定化阿達(dá)木單抗IgG和TNF-a的解離速率常數(shù)與已發(fā)表的數(shù)據(jù)完全一致。作為一個(gè)重要的結(jié)果，我們觀察到兩種檢測(cè)方向的一致親和力和相似的速率，首次表明方向不會(huì)顯著影響結(jié)合模式及其親和力。

完整阿達(dá)木單抗抗體抗體與其Fab結(jié)合固定化TNF-a的結(jié)合速率常數(shù)的差異可以通過(guò)在Fab結(jié)合的情況下，IgG的第二次結(jié)合事件不存在“錨定效應(yīng)”來(lái)解釋。自然，由于結(jié)合第一個(gè)Fab-臂（第二個(gè)Fab-臂的“強(qiáng)制接近”）后第二個(gè)Fab-臂的局部濃度大幅增加，因此IgGs的第二個(gè)結(jié)合事件以急劇增加的速度發(fā)生。

圖3. TNF-a-阿達(dá)木單抗相互作用。以反向（固定化的TNF-a，A）和正向試驗(yàn)方向（固定化的阿達(dá)木單抗IgG，B）記錄了TNF-a與阿達(dá)木單抗的相互作用。記錄的關(guān)聯(lián)時(shí)間為160秒，分離時(shí)間為7200秒。此外，對(duì)于最高分析物濃度，記錄了18，000 s（A）和30，000 s（B）的更長(zhǎng)的分解階段。分析物溶液以1、2、4、8 ns（淺灰色至黑線）的濃度進(jìn)樣。橙色線代表適合數(shù)據(jù)。

表1列出了動(dòng)態(tài)率和幅度。

表1.動(dòng)力學(xué)速率常數(shù)、解離常數(shù)。誤差是單獨(dú)匹配k_OFF的平均值的標(biāo)準(zhǔn)誤差

作為之前描述的結(jié)合動(dòng)力學(xué)測(cè)量的補(bǔ)充方法，我們通過(guò)溶液滴度進(jìn)行了親和力測(cè)量，這排除了由于固定化過(guò)程而可能出現(xiàn)的偽影。將TNF-a和抗體以不同比例混合在溶液中并允許結(jié)合。平衡后，生物傳感器以濃度測(cè)量模式測(cè)量未結(jié)合的TNF-a的剩余分?jǐn)?shù)。在這里，我們使用固定化阿達(dá)木單抗來(lái)檢測(cè)在具有恒定濃度的TNF-a和增加濃度的阿達(dá)木單抗預(yù)孵育的溶液中剩余的具有結(jié)合能力的TNF-a（-復(fù)合物）（圖4A）。進(jìn)行此類實(shí)驗(yàn)的困難在于兩種結(jié)合劑的多價(jià)性（TNF-a三聚體= 3，阿達(dá)木單抗= 2），這導(dǎo)致形成更高級(jí)的復(fù)合物，正如之前所描述的那樣（形成由三個(gè)阿達(dá)木單抗IgGs互連的三個(gè)TNF-a三聚體）。由多個(gè)TNF-a和多個(gè)阿達(dá)木單抗分子組成的幾種不同復(fù)合物可以被表面束縛的阿達(dá)木單抗結(jié)合，這就是為什么圖4A中采用的簡(jiǎn)單1：1匹配模型低估了劑量反應(yīng)的陡峭性，只能被認(rèn)為是一種近似。此外，TNF-a的濃度應(yīng)該在生物學(xué)相關(guān)范圍內(nèi)（必須存在三聚體），但要低到足以仍然到達(dá)KD敏感區(qū)域。對(duì)于這里的實(shí)驗(yàn)，選擇c（TNF-a）為100 pM和500 pM。溶液親和力測(cè)量證實(shí)了動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)中確定的解離常數(shù)，KD（c（TNF-a）= 100 pM）= 53.6±29.5 pM; KD（c（TNF-a）= 500 pM）< 30.0 pM）（圖4 B）。

圖4.溶液平衡滴度親和力測(cè)量。可溶性TNF-a與可溶性阿達(dá)木單抗的結(jié)合（A）。將恒定濃度的TNF-a（100 pM，實(shí)心正方形和500 pM，空心圓）與不同濃度的阿達(dá)木單抗（7 pM至15 ns）混合并孵育7.5小時(shí)。將混合物注射到表面固定化阿達(dá)木單抗中，以確定自由TNF-a的殘留濃度。將線性結(jié)合曲線的斜坡標(biāo)準(zhǔn)化并相對(duì)于可溶性阿達(dá)木單抗?jié)舛壤L制繪圖。從S形轉(zhuǎn)變，確定溶液中Adalimumab-TNF-a結(jié)合的電離常數(shù)（K_{D（c（TNF-a）= 100 pM）}= 53.6±29.5 pM; K_{D（c（TNF-a）}= 500 pM）<30.0 pM）（B）。

在表征多價(jià)性對(duì)TNF-α-阿達(dá)木單抗/阿達(dá)木單抗Fab相互作用中相互作用參數(shù)的影響后，我們研究了TNF-α與5種不同抗TNF-α抗體及其Fab片段復(fù)合物的單體化。為此，將TNF-α固定在傳感器表面上，并用5 nM相應(yīng)的TNF-α清除劑飽和。然后，將表面連續(xù)暴露于TNF-α清除劑（5 nM）以確保清除劑不能有效地從表面解離。這樣，轉(zhuǎn)換速度信號(hào)的增加表明清除劑結(jié)合的TNF-α的衰減，但不是清除劑解離。開(kāi)關(guān)速度監(jiān)測(cè)70分鐘。觀察到所有的TNF-a狂熱結(jié)合物（阿達(dá)木單抗、英夫利西單抗、戈利木單抗）的單體化完全抑制（轉(zhuǎn)換速度沒(méi)有增加），這些結(jié)合物可以形成相互關(guān)聯(lián)的多重結(jié)合復(fù)合物（圖5，純藍(lán)色、品紅色和綠色符號(hào)）。阿達(dá)木單抗和英夫利西單抗的這些發(fā)現(xiàn)與文獻(xiàn)一致。然而，在FRET試驗(yàn)中，與戈利木單抗復(fù)合物中，TNF-a單體化速度更快被發(fā)現(xiàn)。我們僅在源自戈利木單抗的Fab片段中觀察到這種行為，其對(duì)單體化的抑制最弱（圖5，開(kāi)放綠色符號(hào)）。與自由單體化率（圖5，灰色符號(hào)）相比，與戈利木單抗Fab復(fù)合的率僅降低了三倍。相比之下，來(lái)自阿達(dá)木單抗和英夫利西單抗的Fab片段對(duì)單體化表現(xiàn)出更強(qiáng)的抑制作用（圖5，空心藍(lán)色和品紅色符號(hào)）。受控消化抑制了相互連接，但英夫利西單抗Fab和阿達(dá)木單抗Fab的單聚率仍然剛剛提高到可檢測(cè)水平（kMONO=4.0E-5 s^-1）（圖5，空心藍(lán)色和品紅色符號(hào)）。Van Schie還描述了在Certolumab存在下的中等快速單體化。Scallon等人發(fā)現(xiàn)，在Etanercept的存在下，放射性標(biāo)記的TNF-a可以快速替代。在這里，兩種不代表完整抗體的治療形式，即塞爾托珠單抗和依那西普，都顯示出中等快速的單體化（圖5，分別是空心黑色和實(shí)心橙色符號(hào)）。

圖5.通過(guò)治療性抗體形式穩(wěn)定TNF-a三聚體。將TNF-a固定在傳感器表面上，并用5 InM相應(yīng)的TNF-a清除劑飽和;緩沖液注射作為無(wú)抗體對(duì)照。在恒定背景濃度為5 nM的TNF-cleaner下，以1 ml/min的流速記錄了TNF-a-TNF-a-TNF-a-cleaner復(fù)合物中的TNF-a的單體化4200 s。一式三份進(jìn)行測(cè)量并取平均值。單體化率（s-1）取自單指數(shù)曲線（黑色虛線）。

在這項(xiàng)研究中，我們研究了TNF-α寡聚體狀態(tài)轉(zhuǎn)換的動(dòng)力學(xué)。基于以前的研究，報(bào)道了TNF-α的單體化是在數(shù)小時(shí)的時(shí)間尺度上發(fā)生的過(guò)程。雖然純單體化率尚未確定，但只研究了TNF-α三聚體之間單體亞單位交換的監(jiān)測(cè)。在這里，我們提供了在幾分鐘的時(shí)間尺度上，TNF-α的生物活性形式和非活性形式之間相對(duì)快速轉(zhuǎn)變的數(shù)據(jù)。

這種單體化的實(shí)時(shí)評(píng)估可能有助于更深入地了解通過(guò)調(diào)節(jié)TNF-α的生物活性對(duì)炎癥的整體調(diào)節(jié)。TNF-α寡聚體狀態(tài)的濃度依賴性調(diào)節(jié)的高度動(dòng)態(tài)性質(zhì)允許在確定的區(qū)室中產(chǎn)生強(qiáng)烈的免疫反應(yīng)，而不會(huì)遇到全身性炎癥的風(fēng)險(xiǎn)。TNF-α三聚體通過(guò)在較低血清水平下快速分解表現(xiàn)出的生物活性的快速喪失而具有一種內(nèi)在的保護(hù)性開(kāi)關(guān)。迄今為止，準(zhǔn)確測(cè)定生物樣品中的細(xì)胞因子濃度仍然是一項(xiàng)具有挑戰(zhàn)性的任務(wù)。因此，此處顯示的體外再三聚化實(shí)驗(yàn)的絕對(duì)TNF-α濃度的比較是不可靠的。

此外，TNF-α三聚體的快速形成和衰減使得復(fù)雜溶液中的精確定量更加困難。在平衡條件下，TNF-α-阿達(dá)木單抗和TNF-α-阿達(dá)木單抗Fab復(fù)合物中單體化的一般抑制已經(jīng)用HP-SEC和FRET分析進(jìn)行了表征。然而，F(xiàn)RET測(cè)量不能區(qū)分單體化的抑制是高級(jí)寡聚復(fù)合物(例如三個(gè)TNF-α三聚體和三個(gè)阿達(dá)木單抗分子的熱最穩(wěn)定的等摩爾復(fù)合物)形成的產(chǎn)物，還是由三聚體內(nèi)TNF-α單體亞單位界面中單個(gè)阿達(dá)木單抗(Fab)分子結(jié)合引起的。從動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)(圖2和圖3)可以明顯看出，無(wú)論何時(shí)TNF-α被各自的拮抗劑飽和，在兩種檢測(cè)方向上，全阿達(dá)木單抗IgG和阿達(dá)木單抗Fab都發(fā)生了單體化的抑制。

然而，我們?cè)赥NF-α-阿達(dá)木單抗/阿達(dá)木單抗Fab相互作用中觀察到正向和反向測(cè)定方向之間的兩個(gè)實(shí)質(zhì)性差異。阿達(dá)木單抗Fab與固定化TNF-α的結(jié)合速率明顯低于所有其他相互作用。完整阿達(dá)木單抗IgG與其Fab結(jié)合固定化TNF-α的結(jié)合速率常數(shù)的差異可以用Fab結(jié)合時(shí)IgG第二結(jié)合事件的“錨定效應(yīng)”的缺失來(lái)描述。自然地，IgG的第二結(jié)合事件以急劇增加的速率發(fā)生，這是由于在結(jié)合第一Fab時(shí)第二Fab的局部濃度強(qiáng)烈增加(“第二Fab的被迫接近”)。此外，相對(duì)解離幅度存在差異:只有排除固定配體分子的“橋接”(圖2A)，才能實(shí)現(xiàn)完全解離。據(jù)我們所知，阿達(dá)木單抗全I(xiàn)gG和阿達(dá)木單抗Fab與TNF-α相互作用的動(dòng)力學(xué)分析和比較是皮摩爾結(jié)合物的首次相互作用分析，其速率常數(shù)一致，與檢測(cè)方向無(wú)關(guān)。除此之外，對(duì)于停留時(shí)間> 10，000 s的抗體或fab，以前沒(méi)有顯示完全解離。只有協(xié)同使用二維配體分布、固定抗原的低表面密度和非常高的流速，才能抑制分析物不可避免的再結(jié)合，從而損害解離幅度和速率。然而，即使通過(guò)優(yōu)化實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，兩種多價(jià)結(jié)合物如TNF-α及其清除劑抗體的表征和定量分析仍然是一項(xiàng)具有挑戰(zhàn)性的任務(wù)。

在以單價(jià)阿達(dá)木單抗Fab作為可溶性分析物分子的分析中，可以排除包含多個(gè)TNF-α三聚體的復(fù)合物的形成。因此，我們得出結(jié)論，單體化的抑制不僅僅是高階復(fù)合物形成的產(chǎn)物。我們的數(shù)據(jù)表明，TNF-α清除劑與TNF-α三聚體中單個(gè)單元之間的界面凹槽的結(jié)合足以抑制單體化。

基于阿達(dá)木單抗Fab和英夫利昔單抗Fab與TNF-α復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)，預(yù)計(jì)在單體化抑制方面有很大差異。阿達(dá)木單抗Fab明顯結(jié)合在亞單位的界面上，而英夫利昔單抗Fab僅結(jié)合單個(gè)亞單位。本研究中三聚體穩(wěn)定的功能分析不能檢測(cè)阿達(dá)木單抗Fab或英夫利昔單抗Fab之間的差異，也不能檢測(cè)親本IgG之間的差異(圖5)。

Ono等人的數(shù)據(jù)顯示，與TNF-α三聚體的單體亞單位的界面結(jié)合是Golimumab、TNFR2和Certolizumab的共同特性。在這里，我們觀察到在Golimumab Fab、Certolizumab和依那西普的復(fù)合物中對(duì)單體化的抑制作用較弱。TNF-α拮抗劑對(duì)TNF-α三聚體的不同穩(wěn)定作用可能在優(yōu)化這些清除劑的治療應(yīng)用中發(fā)揮作用。

本研究中的實(shí)驗(yàn)均通過(guò) heliX + 分子互作分析系統(tǒng)完成