當(dāng)前有多種技術(shù)可用于體外分子互作檢測，每種技術(shù)都存在特定的優(yōu)勢和不足之處，因此，對于特定的分子互作檢測，如何選擇更加合適的技術(shù)，是廣大科研人員面臨的一種挑戰(zhàn)。目前諸多方法中，歸納起來，可以分為微流控表面結(jié)合法（例如表面等離子共振技術(shù)（SPR)或switchSENSE技術(shù)）或溶液中檢測法（比如等溫滴定熱分析（ITC）或微尺度熱泳分析（MST））。溶液中檢測法在樣本制備方面存在優(yōu)勢，同時(shí)不需要分子固定步驟，操作上更加簡便；而以分子固定為基礎(chǔ)的方法，對樣本的需求量較少，能夠提供底物分子與配體分子解離方面的信息。本文主要是針對switchSENCE技術(shù)的介紹及標(biāo)準(zhǔn)操作流程手冊（SOP）中關(guān)于核心耗材芯片操作部分介紹，目的是指導(dǎo)儀器操作者深入了解及更加熟練準(zhǔn)確的使用該技術(shù)。本文內(nèi)容涉及配體偶聯(lián)，芯片介紹及操作。通過對該過程的了解，可以幫助科研人員評估switchSENCE技術(shù)是否適用于當(dāng)前的應(yīng)用。switchSENSE技術(shù)優(yōu)勢體現(xiàn)在微流控芯片上，實(shí)現(xiàn)以DNA為基礎(chǔ)的可控的配體分布，允許同時(shí)固定兩種不同的配體分子，并可調(diào)節(jié)兩種配體分子的固定比例，實(shí)現(xiàn)研究項(xiàng)目的特定需求。該技術(shù)可實(shí)現(xiàn)多種參數(shù)的表征，比如結(jié)合動(dòng)力學(xué)，親和性，酶活性檢測以及蛋白構(gòu)象變化檢測。

背景介紹

本文關(guān)于switchSENSE技術(shù)的SOP，其內(nèi)容包括整體SOP的一部分，涉及配體-DNA分子偶聯(lián)原理，芯片處理和操作建議，switchSENSE技術(shù)測量的模式。switchSENSE技術(shù)的核心為固定在微流控芯片上的DNA納米桿（一段短的DNA核苷酸序列）。芯片上的電極可以驅(qū)動(dòng)該攜帶有負(fù)電荷的DNA納米桿（“switched”)，而通過交叉改變電壓，能夠使得DNA納米桿在電場中產(chǎn)生高頻率的擺動(dòng)。納米桿的運(yùn)動(dòng)軌跡可以通過電驅(qū)動(dòng)的時(shí)間相關(guān)的單光子計(jì)數(shù)器對DNA分子上連接的熒光探針信號檢測進(jìn)行實(shí)時(shí)的捕獲。記錄的熒光信號強(qiáng)度與DNA納米桿相對于芯片表面的位置相關(guān)，因?yàn)闊晒馓结樢坏┙咏酒慕饘俦砻妫捎诎l(fā)生能量轉(zhuǎn)移，熒光信號會發(fā)生淬滅。

偶聯(lián)在芯片上的DNA，可以通過與攜帶有配體的互補(bǔ)DNA鏈進(jìn)行雜交，從而實(shí)現(xiàn)芯片的功能化。待測配體-DNA的偶聯(lián)可通過共價(jià)偶聯(lián)或芯片表面配體捕獲兩種方式實(shí)現(xiàn)。由于該芯片很容易進(jìn)行再生以及與配對鏈重新雜交，因此同一張芯片可以實(shí)現(xiàn)多種分子互作檢測的需求，這也是該技術(shù)可用于多種應(yīng)用的根本原因，比如蛋白-蛋白，蛋白-DNA/RNA互作，小分子結(jié)合篩選，親和性檢測，構(gòu)象檢測，核酸酶活性研究。

分子互作的結(jié)合動(dòng)力學(xué)可以在動(dòng)力模式或靜止模式下進(jìn)行。在動(dòng)力模式下，DNA納米桿可經(jīng)電場驅(qū)動(dòng)產(chǎn)生擺動(dòng)，底物分子結(jié)合參數(shù)可經(jīng)DNA擺動(dòng)速率進(jìn)行測量（動(dòng)力應(yīng)答）。底物分子一旦與配體結(jié)合，DNA納米桿的動(dòng)力摩擦系數(shù)增加，其運(yùn)動(dòng)速率隨之降低（請見Fig. 1）。在擺動(dòng)速率上的變化，可用于評估動(dòng)力學(xué)變化及親和性參數(shù)（Kon，Koff，Kd)以及蛋白大小（Dh）或配體和復(fù)合物構(gòu)象變化。總的來說，動(dòng)力模式可以提供關(guān)于分子結(jié)合動(dòng)力學(xué)，蛋白直徑，構(gòu)象改變，熱溶及熱力學(xué)變化，蛋白多聚等；在靜止模式下，DNA在穩(wěn)定的電場中，可保持直立狀態(tài)，底物結(jié)合狀態(tài)可通過熒光距離接近感應(yīng)（FPS）的特性進(jìn)行檢測。熒光染料分子附近發(fā)生的結(jié)合事件將會改變?nèi)玖戏肿痈浇幕瘜W(xué)環(huán)境，導(dǎo)致熒光信號發(fā)生改變。靜止?fàn)顟B(tài)下信號的捕獲與底物分子的大小無關(guān)，例如小分子結(jié)合動(dòng)力學(xué)檢測。靜止模式下，可以獲取結(jié)合動(dòng)力學(xué)，熱溶和熱動(dòng)力學(xué)方面的信息，但是無法獲得蛋白直徑，構(gòu)象改變信息。此外，與動(dòng)力模式相比，靜止模式對于芯片的損耗較小，能夠延長芯片的壽命。

另外一種檢測模式被稱為分子尺，基于熒光染料與芯片表面的相對位置而實(shí)現(xiàn)，多數(shù)應(yīng)用于核酸聚合酶活性檢測，以及聚集體/內(nèi)部交聯(lián)檢測。染料的逐步淬滅能夠指示染料的位置信息以及DNA納米桿的移動(dòng)方向。因此，當(dāng)聚合酶進(jìn)行DNA雙鏈合成時(shí)，由于熒光探針逐步遠(yuǎn)離芯片，能夠?qū)崟r(shí)的檢測到熒光信號的增強(qiáng)。

為了對switchSENSE技術(shù)測量的分子信息進(jìn)行分析和理解，對于Helix+設(shè)備的專業(yè)了解，生物芯片的質(zhì)量檢測以及實(shí)驗(yàn)的優(yōu)化和設(shè)計(jì)，都非常重要。因此，對新的儀器使用者提供綜合性的培訓(xùn)，是十分必要的。

位于德國的Dynamic Biosensors公司提供以swithSENSE技術(shù)為基礎(chǔ)的儀器設(shè)備，為具備兩個(gè)LED光源的DRX2，可以激發(fā)紅色和綠色兩種熒光染料。該SOP適用于雙色DRX2設(shè)備，該設(shè)備被稱為heliX®，在2020年上市。

雖然配體分子必須與DNA分子提前進(jìn)行交聯(lián)，才能應(yīng)用于switchSENSE技術(shù)檢測，溶液中檢測的方法不存在特定的樣本制備流程。然而，對于其他方法，目的樣本需要極高的純度和穩(wěn)定性，為了得到可信的動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)，樣本的存儲濃度需要精確的測量（例如經(jīng)分光光度法）。

heliX®系統(tǒng)與多種緩沖液兼容。推薦使用10mM的鹽溶液以及40mM的添加的單價(jià)鹽，PH值為中性，范圍可從5到10。推薦在緩沖液中添加表面活性劑（例如Tween）以及使用0.2um過濾膜進(jìn)行過濾。當(dāng)在動(dòng)力模式下進(jìn)行測量時(shí)，單價(jià)鹽離子濃度范圍應(yīng)從1到300mM（因?yàn)殡妶鲂枰叩碾x子強(qiáng)度，促進(jìn)電驅(qū)動(dòng)的DNA納米桿移動(dòng)）。熒光測量可在鹽濃度達(dá)到3M下進(jìn)行以及在包含少量的各種細(xì)胞裂解液或血清的溶液中進(jìn)行（可加入EDTA將核酸酶失活）。

Fig. 1 switchSENCE測量的不同模式示意圖

配體-DNA交聯(lián)

該部分介紹了兩種將待測配體固定在芯片表面，使得芯片實(shí)現(xiàn)功能化的方法。配體分子首先通過共價(jià)連接，儀器純化或者芯片上捕獲的方法與互補(bǔ)配對的DNA納米桿鏈進(jìn)行交聯(lián)（請見Fig. 2）。通常情況，共價(jià)連接法優(yōu)于親和捕獲的方法，原因在于共價(jià)連接能夠提供更加穩(wěn)定的配體固定狀態(tài)，防止在解離過程中配體的脫落。但是親和捕獲，不需要復(fù)雜的樣本制備，僅需要少量的樣本即可完成捕獲過程。

Fig. 2 配體與配體鏈共價(jià)偶聯(lián)示意圖

共價(jià)偶聯(lián)

配體蛋白可與單鏈DNA寡核苷酸共價(jià)偶聯(lián)，該DNA寡核苷酸可與芯片表面的DNA納米桿進(jìn)行互補(bǔ)配對。共價(jià)偶聯(lián)需要Dynamic Biosensors GmbH提供商品化試劑盒，按照試劑盒標(biāo)準(zhǔn)流程進(jìn)行操作，提高偶聯(lián)的效率。大多數(shù)的交聯(lián)反應(yīng)是由氨基或硫醇基介導(dǎo)，普遍認(rèn)為氨基的偶聯(lián)效率高于硫醇基。如果反應(yīng)體系中的緩沖液包含伯胺（例如Tris為基礎(chǔ)的緩沖液）或硫醇（例如β巰基乙醇），在對交聯(lián)產(chǎn)物進(jìn)行下一步處理之前，需要進(jìn)行緩沖液替換。對于等電點(diǎn)小于6的蛋白，提供經(jīng)優(yōu)化的商品化試劑盒，其中包含可供選擇的交聯(lián)緩沖液。如果交聯(lián)過程需要添加還原劑，推薦使用TCEP（小于1mM）。

交聯(lián)需要的蛋白量推薦為100-200ug，在數(shù)輪的反應(yīng)后，產(chǎn)生攜帶有配體蛋白的互補(bǔ)核酸鏈。在交聯(lián)過程完成后，通過AKTA或proFIRE純化系統(tǒng)，經(jīng)離子交換層析法去除游離的核酸或過量的蛋白分子。一次switchSENSE測量過程僅需40ul，250nM的配體-核酸交聯(lián)產(chǎn)物。Dynamic Biosensors GmbH為交聯(lián)純化流程提供了完整詳細(xì)的操作步驟。

總結(jié)說來，互補(bǔ)配對的寡核苷酸鏈和含有交聯(lián)連接子的溶液進(jìn)行混合，反應(yīng)完成后，過量的連接子被除去，接著向反應(yīng)體系中加入待檢測的配體蛋白。交聯(lián)過程可在室溫下進(jìn)行1h，也可在4攝氏度的條件下過夜反應(yīng)。后續(xù)使用AKTA或proFIRE純化系統(tǒng)對偶聯(lián)產(chǎn)物進(jìn)行純化，即將交聯(lián)產(chǎn)物加入到純化儀器中，并由預(yù)先準(zhǔn)備的不同鹽離子濃度的溶液對純化柱中的產(chǎn)物進(jìn)行洗脫。收集管可根據(jù)各產(chǎn)物的特性及洗脫時(shí)間的差異收集產(chǎn)物，將目的產(chǎn)物與游離的DNA或蛋白區(qū)分開來。該過程同時(shí)包含對配體溶液進(jìn)行質(zhì)量控制的流程。在目的產(chǎn)物被收集管收集后，緩沖液替換成40mM的NaCl溶液，交聯(lián)產(chǎn)物的濃度由物質(zhì)在260nm的吸光值和DNA的消光系數(shù)4,90,000 L mol ?1 cm ?1（48個(gè)核苷酸系列）比值共同決定。產(chǎn)物可分裝后保存在-80攝氏度。

親和捕獲

對于芯片表面捕獲法，互補(bǔ)配對鏈可先經(jīng)修飾反應(yīng)，加上接頭。Dynamic Biosensors GmbH 公司提供一系列的捕獲方法，比如Tris-NTA, streptavidin, Protein A, Protein G, anti-GFP, anti-GST, biotin, digoxigenin以及 strep-tactin。無需樣本制備，修飾的DNA鏈經(jīng)互補(bǔ)配對與芯片雜交，然后通過接頭捕獲待檢測的蛋白分子。

switchSENSE生物芯片

heliX®適配芯片具有一個(gè)堅(jiān)固耐用的單玻璃微流控通道，能夠兼容高流速和腐蝕性化學(xué)物質(zhì)。該通道包含兩個(gè)測量點(diǎn)，每個(gè)測量點(diǎn)都能檢測紅色和綠色熒光信號，從而能夠?qū)崟r(shí)參考兩個(gè)信號或同時(shí)多路復(fù)用多達(dá)四個(gè)信號。該芯片還配備了一個(gè)射頻識別標(biāo)簽，便于輕松追蹤，記錄其狀態(tài)和使用歷史。請見Fig. 3.

Fig. 3  heliX®適配芯片示意圖

以下是對芯片的結(jié)構(gòu)介紹：

1. 錨定鏈為48個(gè)寡核苷酸序列，以3'端錨定在芯片表面；

2. 適配體鏈可根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求進(jìn)行定制，其范圍從標(biāo)準(zhǔn)的 96 個(gè)核苷酸序列或任何類型的 DNA 和/或 RNA 序列，到復(fù)雜的結(jié)構(gòu)，例如用于研究大型分子復(fù)合物構(gòu)象變化的 DNA 折紙結(jié)構(gòu)或用于研究雙特異性分析物的超分子 DNA Y 結(jié)構(gòu)。適配體鏈的下半部分與芯片表面的錨定鏈互補(bǔ)——用于檢測點(diǎn)的適配體鏈1和用于檢測點(diǎn)2的適配體鏈2，從而實(shí)現(xiàn)芯片的功能化。在適配體鏈的3'端連接的熒光染料，從多種化學(xué)性質(zhì)各異的染料中選擇，能夠?qū)崿F(xiàn)信號檢測。標(biāo)準(zhǔn)的紅色和綠色染料（Ra 和 Ga）經(jīng)過優(yōu)化，適用于 switchSENSE® 測量，并且與大多數(shù)實(shí)驗(yàn)設(shè)置兼容，而另外四種染料（Rb、Rc、Gb 和 Gc）可用于根據(jù)不同的化學(xué)性質(zhì)優(yōu)化信號檢測；

3. 配體鏈?zhǔn)且环N可替換的48個(gè)核苷酸的鏈，它既可以攜帶感興趣的配體，也可以在實(shí)時(shí)實(shí)驗(yàn)中作為不含配體的對照。感興趣的分子可以通過上述介紹的共價(jià)偶聯(lián)或標(biāo)簽捕獲法實(shí)現(xiàn)。芯片結(jié)構(gòu)請參考Fig. 4

Fig. 4 芯片檢測點(diǎn)整體結(jié)構(gòu)示意圖

switchSENSE生物芯片的測試和操作流程

在開始實(shí)驗(yàn)前，必須運(yùn)行 heliX® 適配器芯片測試，以評估芯片的質(zhì)量和是否適合實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后進(jìn)行芯片測試，以評估其狀況并確保正確儲存（以保持DNA雙鏈形式且不附著配體）。為獲得一致且可靠的結(jié)果，應(yīng)在標(biāo)準(zhǔn)化條件下進(jìn)行芯片測試：在 25°C 的維護(hù)緩沖液（TE40）中，測試和備用溶液中含預(yù)先雜交的適配鏈1和2以及無配體鏈。

芯片測試的工作流程

芯片測試的工作流程由四個(gè)連續(xù)的步驟組成——（1）再生，（2）鈍化，（3）表面功能化以及（4）狀態(tài)測量。

1. 再生過程是通過使用再生溶液使雙鏈DNA納米桿變性來實(shí)現(xiàn)的，這樣單鏈DNA錨定鏈仍附著在芯片電極表面；

2. 在鈍化步驟中，芯片表面會用含硫醇的鈍化溶液進(jìn)行處理。此過程在芯片表面形成一層自組裝單分子層，可防止非特異性結(jié)合并延長芯片的使用壽命；

3. 表面功能化為適配體1-Ra-lfs 和適配體2-Ra-lfs 序列，分別與錨定1和錨定2雜交（請見Fig. 5)。

Fig. 5 芯片測試示意圖

然后，芯片會在維護(hù)緩沖液（TE40）中接受兩步狀態(tài)測量，包括電壓校準(zhǔn)和動(dòng)態(tài)響應(yīng)測量。

電壓校準(zhǔn)提供了關(guān)鍵信息，即有效驅(qū)動(dòng) DNA 納米杠桿所需的最敏感電壓切換范圍。這是通過施加不同的電壓并在每個(gè)步驟記錄熒光信號來實(shí)現(xiàn)的。在足夠負(fù)的電壓下，帶負(fù)電荷的 DNA 納米杠桿完全從表面排斥。隨著電壓向更正值轉(zhuǎn)變，觀察到S型信號下降，這反映了 DNA 納米杠桿逐漸接近淬滅的金表面。此過程的關(guān)鍵讀數(shù)是DNA納米杠桿向下運(yùn)動(dòng)的拐點(diǎn)（見下圖IP），該拐點(diǎn)用于選擇后續(xù)動(dòng)態(tài)響應(yīng)測量的最佳電壓范圍。在對功能適配器芯片進(jìn)行測試時(shí)，軟件會在兩個(gè)紅色通道（R1 和 R2）中識別拐點(diǎn)。拐點(diǎn)應(yīng)在 -50 mV 至 400 mV 的范圍內(nèi)。如果未檢測到拐點(diǎn)，軟件將直接從分析中提供故障排除選項(xiàng)以幫助解決問題。

Fig. 6 芯片測試信號示意圖

接下來進(jìn)行動(dòng)態(tài)響應(yīng)測量，在此過程中，DNA 納米杠桿在維持緩沖液（TE40）中通過交替電壓進(jìn)行驅(qū)動(dòng)。比IP更正的電壓會將 DNA 納米杠桿吸引向淬滅金表面，導(dǎo)致末端連接的熒光團(tuán)發(fā)出的熒光信號降低。相反，比IP更負(fù)的電壓會將納米杠桿從表面推開，從而產(chǎn)生較高的熒光信號。這些數(shù)據(jù)用于確定兩個(gè)電極的開關(guān)幅度（相對幅度，以百分比表示）。功能正常的適配器芯片的相對幅度應(yīng)大于 40%（如表 1 所示）。

表1. 功能性 heliX® 適配器芯片的狀態(tài)參數(shù)：

在 heliOS軟件中設(shè)置芯片測試

1. 點(diǎn)擊如Fig. 7所示的圖標(biāo)打開分析；

2. 選擇“新建”以創(chuàng)建新的檢測工作流程；

3. 重命名新的檢測工作流程（例如，CT ID XXX）并確認(rèn)更改；

提示輸入您的芯片 ID 作為檢測名稱，以便將您的芯片測試數(shù)據(jù)與相應(yīng)的芯片關(guān)聯(lián)起來；

4. 點(diǎn)擊軟件圖標(biāo)進(jìn)行保存；

5. 點(diǎn)擊（+）圖標(biāo)添加新的檢測方法；

 Fig. 7 軟件中建立芯片檢測實(shí)驗(yàn)

6. 轉(zhuǎn)到“檢測”并選擇“芯片測試”；

7. 點(diǎn)擊“添加檢測”以確認(rèn)，此時(shí)默認(rèn)的芯片測試檢測方法將自動(dòng)打開；

8. 通過打開“芯片”下拉菜單選擇相應(yīng)的芯片位置（默認(rèn)位置 1）。如果芯片測試是系列實(shí)驗(yàn)的一部分，且需要不同條件（例如PE140、TE140 等），您還可以選擇不同的運(yùn)行緩沖液。但請注意，芯片測試始終在維護(hù)緩沖液（TE40）中進(jìn)行；

9. 點(diǎn)擊樣品托盤按鈕（燒瓶圖標(biāo)）以預(yù)覽樣品和緩沖液的位置；

10. 彈出樣品托盤，按照軟件提示放置小瓶，即再生溶液置于（1）位，測試和備用溶液置于（2）位，10毫升去離子水瓶（無蓋）置于（A）位，10 毫升鈍化溶液瓶（有蓋）置于（B）位；

11. 點(diǎn)擊“運(yùn)行”按鈕，分析啟動(dòng)向?qū)⒋蜷_。按照提示順序操作，直到可以點(diǎn)擊“開始分析”。

Fig. 8 芯片檢測中軟件自動(dòng)實(shí)驗(yàn)流程圖

heliOS 中的芯片測試評估

heliOS 提供了自動(dòng)的 heliX® 適配器芯片測試分析功能，旨在快速評估您的芯片質(zhì)量。要分析芯片測試的結(jié)果，只需在實(shí)驗(yàn)文件底部選擇“分析”，然后在自動(dòng)分析向?qū)е羞x擇 heliX 適配器芯片測試作為分析類型即可。

 Fig. 9 芯片檢測結(jié)果軟件分析界面

該分析包含四項(xiàng)自動(dòng)質(zhì)量檢查，用于評估芯片測試（請參見下面的示例，其中淺藍(lán)色軌跡代表檢測點(diǎn)1，深藍(lán)色軌跡代表檢測點(diǎn)2）：

1. 配體注入：這確保了配體注入能產(chǎn)生預(yù)期的熒光增強(qiáng)（上圖）。它還允許通過熒光振幅隨時(shí)間的變化（下圖）直觀評估來自測試溶液和備用溶液的互補(bǔ)鏈與固定錨點(diǎn)的雜交動(dòng)力學(xué)；

2. 拐點(diǎn)：這會驗(yàn)證在電壓校準(zhǔn)期間是否識別出兩個(gè)點(diǎn)的拐點(diǎn)；

3. 相對振幅：這決定了兩個(gè)點(diǎn)（僅在紅色通道中）的相對振幅是否超過功能正常的 heliX® 適配芯片所指定的閾值，如虛線所示；

4. 參數(shù)：這確保了可以從嵌入芯片中的射頻識別標(biāo)簽讀取關(guān)鍵信息（例如：芯片ID、再生次數(shù)和芯片有效期）。

Fig. 10 芯片測試結(jié)果示意圖

switchSENSE技術(shù)在三元復(fù)合物

及雙特異性抗體檢測中的獨(dú)特應(yīng)用

由于該技術(shù)基于操控性強(qiáng)的核酸鏈，并具備雙色檢測系統(tǒng)，因此可用于三元復(fù)合物互作檢測，比如PROTAC分子，雙特異性抗體操作，請見以下示意圖：

Fig. 11 三元復(fù)合物檢測示意圖

通過Fig. 11可知，可在芯片上設(shè)置“Y”型結(jié)構(gòu)，將兩種配體分別與“Y”型兩臂偶聯(lián)，將底物分子，比如PROTAC分子，雙特異性抗體等與兩配體進(jìn)行結(jié)合。檢測的原理為熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET），如果形成三元復(fù)合物，綠色熒光的能量將會轉(zhuǎn)移到紅色熒光，紅色熒光被激發(fā)后，經(jīng)檢測器檢測到信號。通過該種設(shè)計(jì)，可以在同一張芯片上，一次實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)中，同時(shí)檢測二元結(jié)合和三元結(jié)合，并可分析雙抗原之間對配體結(jié)合親和性的互相影響關(guān)系。

本文介紹了switchSENSE技術(shù)SOP中部分內(nèi)容，旨在幫助研究人員了解該技術(shù)原理，為實(shí)驗(yàn)需求選擇更加適合的技術(shù)。

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