在組織工程和再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，人工多細(xì)胞系統(tǒng)正變得日益重要。然而，體外重建復(fù)雜的組織結(jié)構(gòu)充滿挑戰(zhàn)，急需能夠可控且高通量制造復(fù)雜多細(xì)胞結(jié)構(gòu)的方法。該文介紹一種創(chuàng)新的3D細(xì)胞培養(yǎng)方法——基于可編程液滴融合技術(shù)的多球狀細(xì)胞結(jié)構(gòu)組裝（proMAD方法）。這一方法不僅能夠精確控制細(xì)胞組成和空間分布，還能在迷你化、高通量的格式下重建模擬天然組織的復(fù)雜性，可應(yīng)用于細(xì)胞信號、腫瘤侵襲、胚胎發(fā)生和神經(jīng)發(fā)育等多種生物過程的研究。
I.DOT非接觸式移液器：
proMAD方法的技術(shù)核心及優(yōu)勢
proMAD方法無需支架，可以以高通量和小型化的方式自動形成球形組件陣列，以解決細(xì)胞-細(xì)胞通信中使用的細(xì)胞機(jī)制的復(fù)雜性。該方法的核心在于I.DOT非接觸式移液器，它能夠在納升至微升的范圍內(nèi)，非接觸式地將液體從源頭轉(zhuǎn)移到目標(biāo)板。這意味著極低的死體積（<1 μL）和零交叉污染風(fēng)險，為細(xì)胞培養(yǎng)提供了前所未有的精確度和安全性。
與此同時，I.DOT搭載的DropDetection系統(tǒng)，能夠?qū)γ總€液滴進(jìn)行計數(shù)和檢測，提供液體轉(zhuǎn)移性能和總體積的即時反饋。這不僅確保了實驗的可重復(fù)性和可靠性，還極大地提高了實驗效率。
利用該文作者已開發(fā)的液滴微陣列（DMA）平臺[1-3]，它可以制造納米升液滴微陣列，其中液滴的形狀、大小和密度取決于被超疏水屏障包圍的親水性圖案的設(shè)計。DMA平臺可以在數(shù)百個單獨的納升液滴中培養(yǎng)和高通量篩選各種細(xì)胞類型，這些液滴作為獨立的小型化棲息地[4]。
在DMA平臺上使用懸滴法制備單細(xì)胞球體，使用了由14 × 14個親水點（每個1 mm × 1 mm）組成的DMA，點之間的距離為500 μm（圖1）。以HepG2細(xì)胞為例，將細(xì)胞懸液以200 nL的液滴形式通過I.DOT非接觸式移液器分配在DMA上，每個液滴含有的細(xì)胞數(shù)量可控制球體直徑（30-150 μm）。然后將DMA倒置，使細(xì)胞在液滴-空氣界面因重力驅(qū)動聚集，培養(yǎng)2天后形成單個球體（圖1a,1b）。采用以下打印順序：為融合4個液滴，將培養(yǎng)基依次添加到D2、E2、D3、E3點（圖1c中藍(lán)色點，每個點多添加900 nL DMEM）；為了融合3個液滴，將培養(yǎng)基依次添加到A1、A2、B2點（圖1f中藍(lán)色點，每個點增加850 nL DMEM）。然后相鄰的液滴融合成一個。將載玻片倒置培養(yǎng)24、48、72、96 h。用Keyence軟件對球體或合并球體進(jìn)行觀察和成像。
proMAD方法的基礎(chǔ)是將額外體積的細(xì)胞培養(yǎng)基分配到相鄰的單個液滴中，并控制它們在超疏水屏障上的融合（圖1）。在相鄰的每個200 nL的液滴中加入900 nL的介質(zhì)（即每個點總共加入1100 nL），相鄰的液滴會自發(fā)合并成一個新的大液滴，并牢固地附著在兩個親水點上（圖1）。合并液滴后，將DMA載玻片再次倒置進(jìn)行培養(yǎng)，使先前分離的兩個球體在液滴底部接觸，并使它們粘附融合成多球體復(fù)合物（圖1a）。同樣，通過增加多個相鄰液滴的體積來合并兩個以上的液滴（圖1c-h）。有趣的是，這導(dǎo)致了由多個單獨的細(xì)胞球體組成的融合球體的形成。為了融合兩種不同的細(xì)胞系，選擇了兩種不同的細(xì)胞系：HeLa RFP細(xì)胞和HEK 293T細(xì)胞。用共聚焦顯微鏡檢查合并的球體。
圖1. 可編程液滴融合技術(shù)（proMAD）。a)利用親水點被超疏水邊界分隔的小型化液滴微陣列（DMA）形成細(xì)胞球體陣列的示意圖。為了實現(xiàn)球體的可編程裝配，通過增加相鄰液滴的體積來合并液滴。b)單個HepG2球體14 × 14陣列顯微鏡圖像。c, f）多液滴在DMA上可控合并的打印方案。使用以下印刷體積：900 nL /液滴，用于融合2或4個液滴；850 nL /液滴，將3個液滴融合在一起（(c)和(f)中的藍(lán)色點）。d, g)含有2、3和4個合并液滴的DMA顯微鏡圖像。e, h)融合24 h后融合水滴中的4個球體和3個球體圖像
1. 球體特征分析：使用ImageJ軟件測量和計算球體的圓形度、縱橫比、圓度和密實度等參數(shù)[5]；
2. 融合過程分析：通過ImageJ軟件的角度工具測量兩個融合球體在不同融合時間點的夾角，用長度測量工具測量兩個球體之間融合區(qū)域（“頸部”）的長度[5]；
3. 細(xì)胞活力檢測：融合后24 h收集雙球體，用 PBS 洗滌后，用 Calcein- AM和碘化丙啶染色15 min（37°C），然后通過熒光顯微鏡成像檢測細(xì)胞活力[5]；
4. 免疫染色：收集并洗滌球體后，用 4% 多聚甲醛固定，0.5% Triton X - 100 透化，1% BSA 封閉，依次加入抗 - E - 鈣粘蛋白抗體和 Alexa Fluor 488 標(biāo)記的二抗，最后用 DAPI 染色，通過共聚焦顯微鏡成像[5]；
5. 掃描電鏡固定：融合后 24 h 收集球體，用 PBS 洗滌，依次用 2.5% 戊二醛溶液固定、不同濃度乙醇和水脫水、50% 和 100% HMDS 處理，然后轉(zhuǎn)移到干凈玻片上干燥，通過掃描電子顯微鏡成像[5]。
6. 球體間Wnt信號傳導(dǎo)：產(chǎn)生HEK 293T Wnt-3a，以及穩(wěn)定的HEK 293T TOP-GFP報告細(xì)胞系按照規(guī)劃程序進(jìn)行播種[6]。將產(chǎn)生Wnt的細(xì)胞打印在第1、3、5、7、9、11、13列，報告細(xì)胞打印在第2、4、6、8、10、12、14列。掛滴法培養(yǎng)2天后，每個點加入900 nL DMEM合并相鄰點。為了研究Wnt信號傳導(dǎo)，每24小時用熒光顯微鏡和共聚焦顯微鏡檢查合并的球體。
1、對于融合的球體，定義了 “結(jié)合數(shù)” 來描述單個球體在融合過程中與相鄰球體的作用。在這個過程中，I-DOT對前期球體的精準(zhǔn)分配影響了后續(xù)融合的球體的各種數(shù)據(jù)。通過模擬算法和實驗結(jié)果統(tǒng)計量化了合并球體 “結(jié)構(gòu)異構(gòu)體” 的組合概率。例如，3個球體融合時有兩種可能的結(jié)構(gòu)，線性組合A1A2A1和三角形結(jié)構(gòu)A2A2A2，實驗概率分別為61% 和39%，模擬算法得到的概率分別為85%和15%（圖2a）；
除了融合可變數(shù)量的同源球體外，還可以融合由不同細(xì)胞類型形成的球體（圖2b）。在多細(xì)胞生物中，組織由多種具有空間組織的細(xì)胞類型組成，這些細(xì)胞類型協(xié)同工作以執(zhí)行特定功能。圖2b的結(jié)果顯示，即使在融合過程24小時后，異質(zhì)球體中兩種細(xì)胞類型之間仍有明確的邊界。因此，proMAD方法可以通過合并特定數(shù)量的相鄰液滴來實現(xiàn)單個球體的可控組裝，從而產(chǎn)生多球體聚集體，以及陣列格式的異質(zhì)球體架構(gòu)。
圖2. 由proMAD方法形成的多球體結(jié)構(gòu)的例子。a)不同HepG2多球體的示意圖、概率和相應(yīng)的例子。“結(jié)合數(shù)”對應(yīng)于配合物的各個球體之間的結(jié)合位點的數(shù)量，顯示在方案上的每個球體中。α，在理論模型中，將細(xì)胞球體視為球體，并通過模擬算法給出組合概率。β，組合概率由實驗統(tǒng)計得出（3個球體，n = 33, 4個球體，n = 32）。b)兩種不同細(xì)胞系（表達(dá)RFP和HEK 293T的HeLa細(xì)胞用綠色熒光5-氯甲基熒光素雙乙酸酯染色）合并后24小時構(gòu)建的異球結(jié)構(gòu)的熒光顯微鏡圖像：A1B1，A1B2B1，A2A2B2和A2B2B3A1。
2、為了觀察球體融合的過程，我們在液滴融合后的5天內(nèi)，在規(guī)定的時間點用顯微鏡監(jiān)測了兩個球體融合在一個液滴中的情況（圖3a）。兩個HepG2球體首先融合成花生狀結(jié)構(gòu)，水滴融合后24-96 h形成固體融合橢圓形結(jié)構(gòu)（圖3a）。在觀察兩個球體融合過程中，測量了融合點的切線角度和融合區(qū)域的長度。融合2 h后，兩個原始球體的形狀仍可清晰辨認(rèn)，夾角在57° ± 16°到154° ± 11°之間，融合區(qū)域長度約為40.7 ± 6.8 μm；48 h后夾角大于，96 h完全融合時夾角接近，融合區(qū)域長度逐漸增加到138 ± 10μm（圖3c），共培養(yǎng)48 h后，合并后96 h，兩個球體之間的夾角在110°以上，逐漸接近180°，完全融合（圖3a,b）。我們稱之為“頸部”的合并區(qū)域的長度（圖3a,橙色虛線）。
此外，作者還使用細(xì)胞-細(xì)胞相互作用模型來模擬兩個球體的融合過程（圖3d）[7]。熱圖（圖3e）顯示了融合過程中單個細(xì)胞的相對位移，表明球體中的細(xì)胞已經(jīng)重新分布，形成新的橢圓形結(jié)構(gòu)。在我們的實驗和模擬中，融合后96 h雙球體的總長度分別減少了約18%。
圖3. 兩胞球體融合過程的實驗與模擬研究。a)兩個HepG2球體初次接觸96小時后融合的亮場顯微鏡圖像。b)合并球體間夾角隨時間變化的曲線圖。(a)中的藍(lán)色虛線表示角度。c)顯示合并球體隨時間變化的頸部長度（橙色虛線顯示在(a)中）的圖。(b)和(c)中的誤差條表示10個不同合并球體的SD。d)兩個球體（球體直徑150μm， 400個細(xì)胞）融合過程的三維模擬。e)熱圖顯示融合過程中單個細(xì)胞的時空運(yùn)動。彩色地圖表示每個細(xì)胞相對于其初始位置的位移（t = 0）。kMCS是時間尺度，代表kilo Monte Carlo sweep。
3、為觀察兩球體合并區(qū)域細(xì)胞狀況，進(jìn)行了E-cadherin免疫染色和掃描電鏡成像（圖4a）。E-cadherin免疫染色用于可視化細(xì)胞粘附和連接[8]，結(jié)果顯示在融合的雙球體內(nèi)均勻分布，表明球體是生物融合而非物理吸附。掃描電鏡成像證實了 “花生” 形融合復(fù)合體的形成及單個球體界面細(xì)胞間的緊密相互作用（圖4b）。這些結(jié)果表明，用特定方法獲得的多球體三維結(jié)構(gòu)，在球體之間具有緊密的細(xì)胞間接觸，利于研究細(xì)胞間相互作用及相關(guān)生物過程。
圖4. 兩胞球體融合過程的實驗與模擬研究。多球體結(jié)構(gòu)中的細(xì)胞-細(xì)胞相互作用。a)融合24 h后兩個HepG2球體的熒光顯微鏡圖像。e -鈣粘蛋白染色（綠色熒光）顯示細(xì)胞間連接。DAPI（藍(lán)色熒光）顯示細(xì)胞核。合并：DAPI覆蓋層，E-Cadherin染色。b)融合后球體（HepG2，融合后24 h）的SEM圖像。左圖是在2000倍放大率下拍攝的。右上方圖像（藍(lán)框）在7000倍放大下顯示單個球體內(nèi)細(xì)胞-細(xì)胞接觸。右下角（橙色框）在7000倍放大下顯示了雙球體的接觸“頸部”區(qū)域。
4、使用proMAD方法將產(chǎn)生Wnt的球體（HEK 293T, Wnt-3a）與報告球體（HEK 293T, TOP-GFP）融合（圖5a）。融合后24和48小時，通過測量TOP-GFP報告球體的熒光強(qiáng)度來監(jiān)測Wnt信號活性（圖5b）。報告球體共培養(yǎng)24 h后平均熒光強(qiáng)度為45.3 ± 10.0，共培養(yǎng)48 h后平均熒光強(qiáng)度為58.3 ± 5.7（圖5b）。共培養(yǎng)48小時后，整個報告球體顯示出均勻的GFP熒光，表明在球體的所有細(xì)胞中Wnt信號被強(qiáng)烈激活（圖5c-i，ii）。對照實驗僅顯示較弱的GFP強(qiáng)度（圖5c-i，ii） [9,10]，融合后24和48 h的平均熒光強(qiáng)度分別為3.0 ± 1.1和2.9 ± 0.9。在Wnt-3a存在下，TOP-GFP Wnt報告球體的熒光強(qiáng)度比對照球體增加了約15倍（24 h）和大約20倍（48 h）。
接下來，研究測試了Wnt信號在三重球體復(fù)合體中的傳播，將兩個報告球體與一個產(chǎn)生Wnt-3a的球體合并，然后選擇兩種不同的融合球體架構(gòu)進(jìn)行分析。在第一種結(jié)構(gòu)中，兩個報告球體呈線性結(jié)構(gòu)排列，產(chǎn)生Wnt的球體位于一端（圖5d）。與產(chǎn)生Wnt直接相鄰的報告球體被強(qiáng)烈激活，而位于遠(yuǎn)端的報告球體被不那么強(qiáng)烈激活（圖5d，f）。在第二種組合中，兩個報告球體位于生產(chǎn)者球體的兩側(cè)，顯示出兩個報告球狀體在同等程度上的強(qiáng)烈激活（圖5e，g）
圖5. 合并球體之間的Wnt信號。a)由產(chǎn)生球體（HEK 293T、Wnt-3a）和報告球體（HEK 293T、TOP-GFP）組成的多球體復(fù)合物構(gòu)成的Wnt信號傳播系統(tǒng)示意圖。b)報告球體激活圖。通過共聚焦圖像中GFP熒光的強(qiáng)度來估計激活。(GFP強(qiáng)度由至少10個合并的球體計算。***, P < 0.001，單因素方差分析)c)共聚焦圖像顯示GFP熒光估計報告球體中Wnt/β-catenin信號的激活。i) HEK 293T球體（對照）和報告球體的合并球體。白色箭頭指向微弱的GFP熒光。ii)一個Wnt產(chǎn)生球（HEK 293T）和一個Wnt報告球（HEK 293T, TOP-GFP）的合并球。白色箭頭指向Wnt傳播方向。d,e)所研究的兩個三重球體的示意圖和熒光顯微鏡圖像，其中一個Wnt產(chǎn)生球體（HEK 293T）和兩個Wnt報告球體（HEK 293T, TOP-GFP）。f)如圖(d)所示三重球體白色虛線上GFP熒光強(qiáng)度分布圖。g)如圖(e)所示三重球體白色虛線上GFP熒光強(qiáng)度分布圖。
本文通過proMAD方法成功實現(xiàn)了多個同型或異型球體的融合，形成了雙球體、多球體和異質(zhì)球體等各種多球體結(jié)構(gòu)，并確定了不同結(jié)構(gòu)的組合概率。與現(xiàn)有的3D細(xì)胞培養(yǎng)方法相比，proMAD方法具有諸多獨特優(yōu)勢。如高通量、小型化、已操作及快速形成復(fù)雜多極結(jié)構(gòu)等。I-DOT在前期球體的制備過程中保證了每個液滴的準(zhǔn)確性，間接影響了最終多球體結(jié)構(gòu)的形成。同時，該方法也為研究3D細(xì)胞培養(yǎng)模型中的細(xì)胞信號傳導(dǎo)提供了強(qiáng)大工具，I-DOT在多個關(guān)鍵步驟中發(fā)揮重要作用的同時，更有助于在更接近生理條件下研究各種生物學(xué)過程，為組織工程和再生醫(yī)學(xué)的發(fā)展提供新的思路和方法。
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