人誘導多能干細胞（hiPSCs）是疾病建模、再生醫學的核心工具，但傳統培養依賴Matrigel等動物源涂層，存在批次差異大、臨床應用受限的問題；而人源重組蛋白篩選因傳統高通量篩選（HTS）試劑消耗大、成本高難以推進[1]。dropletmicroarray（DMA）平臺憑借超微量反應（200 nL/斑點）、低消耗（蛋白用量僅為96孔板的1/860）的優勢，為解決這一難題提供了新思路。本研究通過DMA篩選231種人源蛋白組合，成功挖掘出可長期維持hiPSCs多能性的無動物源涂層，為hiPSCs臨床轉化與基礎研究奠定基礎。
采用超疏水-親水界面構建的DMA芯片（7.5×2.5cm，含672個1 mm×1 mm獨立斑點，圖1），選取11種人源蛋白（如EphB4、EpCAM、LN521等），設計單組分、55種二元組合及165種三元組合，共231組篩選體系，以Matrigel為陽性對照、無涂層為陰性對照。
圖1. 篩選工作流程的示意圖。打?。簩?0 nL的蛋白質溶液(每個蛋白質的最終濃度為10μg mL-1)打印到每個預定的點上，在RT下孵育2 h，然后加入細胞懸液。培養：hPSCs按200 nL/斑點的體積配制，培養24 h后IF染色檢測NANOG的表達。圖像分析：定量IF染色的平均熒光強度。圓圈的大小和顏色與免疫熒光法測定的NANOG的相對表達相對應：左下角對應Matrigel對照的表達，紅色和小圓圈表示NANOG的表達低于Matrigel對照，綠色和大圓圈表示NANOG的表達高于Matrigel。初步的HTS包括11個單一蛋白、55個二元組合和165個三元組合，共231個篩選組。驗證：選擇HITS，并在長達五周的培養期間，通過對一組更大的多能性標記(轉錄因子：Nanog、SOX2、OCT-4A，細胞表面標記：SSEA4、TRA-1-81和TRA-1-60)的免疫熒光染色，在HiPSCs中進一步驗證HIT。比例尺：50 μm。
蛋白涂層制備：通過I.DOT非接觸式納升級移液系統將60 nL濃度為10μg/mL的蛋白溶液精準打印至DMA斑點，室溫孵育2h實現涂層（圖1流程第一步），全程維持70%濕度避免液滴蒸發，確保微量蛋白溶液的均一性與穩定性。
hiPSCs接種與培養：同樣使用I.DOT打印200 nL hiPSCs懸液至蛋白涂層斑點（圖1流程第二步），將DMA置于含濕潤墊的培養皿中，37℃、5%CO?培養24h（圖1流程第二步）
培養后通過免疫熒光染色檢測多能性標志物 NANOG（圖 1流程第三步），利用自動熒光顯微鏡成像并量化熒光強度（圖 1流程第四步）；對初篩陽性組合進行5代長期培養，通過qPCR和免疫熒光驗證多能性標志物（NANOG、SOX2等），并通過類胚體（EB）形成實驗驗證三胚層分化能力（圖2A流程）。
圖2. 通過分化成三個胚層來驗證來自初步篩選的兩個命中。A)HiPSCs分化為三個胚層的示意圖。(B)在未分化集落(NC)和表面涂有MG、BIK(EphB4+DAG1+LN521)和GHK(EpCAM+BSG+LN521)的HiPSCs中，檢測FOXA2(內胚層)、brachyury (中胚層)和??-微管蛋白3(外胚層)的標記。比例尺：20 μm。
hiPSCs在DMA上的存活與多能性：非接觸納升級移液系統I.DOT接種的hiPSCs活力達69.43%，顯著高于手動接種的58.28%；細胞表達SOX2、OCT-4A、NANOG等多能性標志物，與微孔板培養結果一致（圖 3A），且E-鈣黏蛋白表達符合多能性特征（圖 3E），證明DMA可維持hiPSCs特性。
實驗質量保障：陽性（Matrigel）與陰性（無涂層）對照的NANOG熒光強度差異顯著，Z'因子達0.64（圖 3D），符合高質量HTS標準，確認篩選體系可靠。
圖3.篩查方案的有效性。A)在涂有Matrigel的DMA玻片上200 nL液滴中培養的HiPSCs的典型共聚焦激光掃描顯微鏡(CLSM)圖像，并對六種多能性標志物進行染色：SOX2、OCT-4A、NANOG、TRA-1-60、SSEA4和TRA-1-81。三個獨立的實驗(n=3)獲得了可比較的結果。用DAPI對細胞核進行反染。比例尺：50μm。b)陽性對照(Matrigel，MG+)和陰性對照(非Matrigel，MG?)培養的HiPSCs的亮視野圖像。標尺：100μm. c)NANOG表達水平作為初步篩選的讀數。如果在DMA上進行染色，然后進行自動顯微鏡觀察。一張圖片中的所有菌落都來自這一滴。比例尺：50μm.d)對培養在陽性和陰性對照上的HiPSCs的平均亮度(平均熒光強度)進行定量，并對多能性標記NANOG進行染色。平均熒光強度計算為總熒光強度除以面積(以像素為單位)。*P <0.001，陽性對照和陰性對照有顯著差異。(Z?值介于0.5和1之間，對應于高質量的篩選試驗)。數據以平均值±3SD表示。(n=3)E)陽性和陰性對照涂層培養的HiPSCs中E-鈣粘蛋白表達的CLSM圖像。E-鈣粘附素介導細胞間的相互作用，并有助于干細胞克隆的形成和多能性。因此，在陽性對照涂層上，未分化的HiPSCs高表達E-cadherin，而在陰性對照涂層上，分化的HiPSCs顯示低或不表達E-cadherin。用DAPI對細胞核進行反染。比例尺：25 μm。
231組蛋白組合中，僅三元組合表現出顯著多能性維持能力，10種組合的NANOG表達量顯著高于Matrigel（閾值：mean+3SD，圖4C）。其中BIK（EphB4+DAG1+LN521）和GHK（EpCAM+BSG+LN521）效果最強，NANOG表達分別為Matrigel的2.18±0.32倍和2.00±0.22倍（圖4B、D）；而單組分蛋白及二元組合均未達到陽性閾值，證明蛋白協同作用的重要性。
圖4. 蛋白質初篩結果。A)篩查中使用的蛋白質及其相應字母代碼的清單。B)顯示在含有單一蛋白質和蛋白質組合的涂層上培養的HiPSC中NANOG表達的倍增變化的熱圖。每個獨立陣列實驗使用6個重復。將每個獨立組的NANOG表達的平均熒光強度與在Matrigel(MG)涂層上培養的細胞的NANOG表達水平進行歸一化(陽性對照)。綠色表示NANOG的高表達水平(自我更新能力較強)，紅色表示與陽性對照(MG+)涂層上培養的細胞的標記表達水平相比，NANOG表達較低(自我更新能力較低)。C)在篩選中顯示所有測試蛋白質組的相對NANOG表達的曲線圖。蛋白質包被促進NANOG表達顯著改變的閾值設為Mean+3SD。紅柱表示陰性對照(無涂層，MG?)，綠柱表示陽性對照(MG涂層，MG+)，紫柱顯示陽性hits。D)在初步篩查中確定的前十個陽性hits的列表。
長期培養：BIK和GHK涂層支持hiPSCs連續5代培養，細胞形態呈典型克隆狀（圖S10），NANOG、SOX2、OCT-4A的基因與蛋白表達水平與Matrigel無顯著差異（圖5B、C）；而對照組合DIK（E-Cadherin+DAG1+LN521）雖能促進細胞貼壁，但多能性標志物逐漸下調（圖5B、C）。
三胚層分化：BIK和GHK培養的hiPSCs可形成類胚體（圖2A），并成功分化為內胚層（FOXA2+）、中胚層（brachyury+）和外胚層（β-Tubulin3+），與Matrigel組分化能力一致（圖2B），確認其多能性維持效果。
圖5.蛋白質涂層對hiPSCs長期培養的影響：驗證兩種最有效的三元蛋白質組合(BIK和GHK)的效率。A)hPSCs在非涂層12孔板、Matrigel(MG)涂層12孔板以及DIK、BIK和GHK涂層12孔板上4天的集落附著效率。初步篩選發現BIK(EphB4+DAG1+LN 521)和GHK(EpCAM+BSG+LN 521)表達較強的NANOG，而以DIK(E-鈣黏蛋白+DAG1+LN 521)蛋白培養的細胞NANOG表達較低。數據以平均值±3SD表示。(n=3)在MG、DIK、BIK和GHK涂層上培養的HiPSCs的圖像，并對6種多功能標志物進行染色：Nanog、OCT-4A、SOX2(綠色熒光)；TRA-1-81、SSEA4、TRA-1-60(紅色熒光)。比例尺：50μm。c)生長在MG、DIK、BIk和GHK包被的井板上的hiPSCs 5代(n=3，生物復制)的多能性標記基因(NANOG、OCT4和SOX2)的定量聚合酶鏈式反應分析。對照參考基因GAPDH對基因表達數據進行歸一化。在培養在DiK、BIK和GHK涂層上的HiPSCs中，基因表達水平與生長在MG上的細胞的基因表達水平正常化。數據以均值 ±SEM（標準誤）表示。**P <0.01和*P<0.001，MG組與Dik組之間有顯著差異。
該研究通過DMA平臺實現了hiPSCs多能性維持蛋白組合的超微量高通量篩選，其核心突破在于：一是極致降本增效，僅用0.83 μg蛋白、2.8×10?個細胞完成231組篩選，蛋白與細胞消耗分別僅為96孔板的1/860和1/25，大幅降低人源重組蛋白篩選成本并解決傳統HTS的資源瓶頸；二是提供無動物源解決方案，篩選出的人源蛋白組合BIK（EphB4+DAG1+LN521）和GHK（EpCAM+BSG+LN521）無批次差異與臨床應用限制，可替代Matrigel實現hiPSCs長期培養，為再生醫學臨床轉化提供關鍵工具；三是凸顯I.DOT非接觸式納升級移液系統的核心價值，其能精準打印60nL蛋白溶液與200 nL hiPSCs懸液，避免交叉污染與液滴蒸發，保障微量反應體系的穩定性與重復性，是DMA平臺高效運行的關鍵支撐，未來該技術還可進一步拓展至其他稀缺細胞（如原代細胞）與昂貴分子的篩選，為干細胞生物學、藥物發現等領域提供微型化 HTS新范式。
1.E. A. Aisenbrey, W. L. Murphy, Nat. Rev. Mater. 2020, 5, 539.
