2016年，世界衛(wèi)生組織（WHO）將多替拉韋（DTG）列為HIV感染一線治療藥物，其高效的病毒抑制能力與良好的安全性迅速使其成為全球首選方案。然而，2018年博茨瓦納Tsepamo研究打破了這一樂觀局面——孕期暴露于DTG的女性，胎兒神經(jīng)管缺陷（NTD）風(fēng)險(xiǎn)較非DTG治療組升高9倍（0.94%vs.0.12%）[1]，這一發(fā)現(xiàn)引發(fā)全球?qū)TG妊娠期安全性的高度關(guān)注。
NTD是全球最常見的出生缺陷之一，其發(fā)生與胚胎神經(jīng)管閉合異常密切相關(guān)，而葉酸缺乏是明確的風(fēng)險(xiǎn)修飾因子——孕前3個(gè)月至孕期補(bǔ)充400 μg/天葉酸可降低50%-75%的NTD發(fā)生率[2,3]。值得注意的是，博茨瓦納等未強(qiáng)制實(shí)施葉酸強(qiáng)化食品政策的地區(qū)，人群葉酸缺乏率超過20%，而DTG被證實(shí)可非競(jìng)爭(zhēng)性拮抗葉酸受體1（FOLR1），在臨床治療濃度（3-10 μM）下降低葉酸與受體結(jié)合效率達(dá)46%。這提示DTG的致畸性可能與葉酸水平存在交互作用，但傳統(tǒng)檢測(cè)技術(shù)因無法精準(zhǔn)量化低葉酸狀態(tài)下的代謝波動(dòng)，導(dǎo)致“藥物-營養(yǎng)”協(xié)同效應(yīng)的機(jī)制研究停滯不前。
1.實(shí)驗(yàn)對(duì)象
實(shí)驗(yàn)對(duì)象為CD-1 品系孕鼠（Charles River Laboratories），適應(yīng)性喂養(yǎng) 4 周后分為兩組飲食：正常葉酸組（NF）：3mg/kg 葉酸飲食（模擬人類推薦攝入量[3]）；低葉酸組（LF）：0.3mg/kg 葉酸飲食（模擬葉酸缺乏環(huán)境，葉酸含量?jī)H為正常組 10%）。
2.DTG暴露
胚胎期E6.5-E12.5（神經(jīng)管閉合關(guān)鍵期），通過飲水給予DTG：
對(duì)照組（0X）：飲用純水；
治療劑量組（1X）：3.5mg/L（人類等效劑量[4]）；
超治療劑量組（5X/10X）：17.5mg/L、35mg/L，模擬臨床過量暴露場(chǎng)景；
樣本量：每組20-24只孕鼠，足月（E18.5）剖宮取胎，共檢測(cè)1200+胎兒。
基于葉酸結(jié)合蛋白（FBP）的競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合法，利用Dispendix I.DOT 非接觸式液體處理器構(gòu)建高靈敏度檢測(cè)體系[5]：
1. 探針陣列打印：在96孔板底部以2×2陣列形式打印50ng/mLFBP（Sigma-AldrichF0504），單孔反應(yīng)體積僅40μL（傳統(tǒng)方法需200μL），試劑消耗降低80%；
2. 標(biāo)準(zhǔn)曲線構(gòu)建：配置0.09375-6ng/mL葉酸標(biāo)準(zhǔn)品，結(jié)合葉酸-辣根過氧化物酶共軛探針（FA-HRP），通過化學(xué)發(fā)光底物（ThermoScientificSuperSignal）實(shí)現(xiàn)納克級(jí)精準(zhǔn)定量，檢測(cè)下限達(dá)0.05ng/mL；
3. 數(shù)據(jù)優(yōu)勢(shì)：非接觸式分配避免交叉污染（污染率<0.01%），變異系數(shù)（CV）僅3.2%，較手動(dòng)移液（CV>15%）精度提升4倍，成功捕捉低葉酸組血清葉酸濃度波動(dòng)[6]。
1.大體觀察：記錄胚胎著床數(shù)、活胎數(shù)、死胎數(shù)，計(jì)算植入后丟失率；
2.組織學(xué)分析：采用Wilson技術(shù)解剖軟組織結(jié)構(gòu)，檢測(cè)神經(jīng)管缺陷（露腦畸形）、腭裂；
3.骨骼染色：阿爾新藍(lán)-茜素紅雙染法觀察頸椎/胸椎融合、肋骨畸形等骨骼異常[7]。
低葉酸+DTG組：3窩共4例胎兒出現(xiàn)露腦畸形（圖1A），發(fā)生率0.415%，顯著高于歷史對(duì)照（0.01%），F(xiàn)isher精確檢驗(yàn)p=0.0007（表2）；
正常葉酸組：無論DTG劑量（1X/5X/10X），均未觀察到NTD，證實(shí)充足葉酸可完全屏蔽DTG的致畸風(fēng)險(xiǎn)（表1）。I.DOT關(guān)鍵數(shù)據(jù)：低葉酸組血清葉酸均值5.73±0.97ng/mL，雖未達(dá)貧血閾值，但變異顯著升高（p=0.0483），提示個(gè)體間葉酸利用差異放大DTG風(fēng)險(xiǎn)（表1）。
圖1. 觀察大體和內(nèi)部表型的形態(tài)學(xué)。具有A）露腦神經(jīng)管缺陷、B）正常頭部形態(tài)、C）腭裂和D）正常腭形態(tài)的CD 1 E18.5小鼠的代表性圖像。
表1. 具有平均值和標(biāo)準(zhǔn)差的妊娠結(jié)局的總結(jié)
腭裂：正常/低葉酸組共3窩出現(xiàn)腭裂（圖2C），與DTG暴露顯著相關(guān)（p=0.0167），提示DTG對(duì)顱神經(jīng)嵴細(xì)胞遷移的干擾不依賴葉酸水平（表2）；
骨骼異常：低葉酸+10XDTG組肋骨畸形率達(dá)13%（3窩17例），主要表現(xiàn)為肋骨融合/多余肋骨，而正常葉酸組僅2%（2窩4例），I.DOT檢測(cè)顯示高劑量DTG下葉酸受體抑制率從30%升至55%（表3）。
表2. 大體和軟組織畸形總結(jié)
表3. 骨骼畸形和變異總結(jié)
各組母鼠體重增長(zhǎng)、血常規(guī)、肝腎功能均無顯著差異，證實(shí) DTG 毒性主要靶向胚胎發(fā)育，而非母體健康（圖2，表1）
圖2.整個(gè)妊娠期間母體平均體重增加。正常喂養(yǎng)的母鼠（3.0毫克/千克，實(shí)線）和低（0.3mg/kg，虛線）葉酸飲食用0X（正常飲食n=21，低飲食n=24，藍(lán)色），1XHED（3.5毫克/升）（正常飼料n=23，低水平飼料n=20，綠色），5XHED（17.5mg/L）（正常飲食n=20，低飲食n=20，黃色）或10XHED（35mg/L）（正常飲食n=21，低飲食n=20，橙色）DTG從E6.5至E12.5。每隔一天對(duì)母鼠稱重。條表示標(biāo)準(zhǔn)偏差。
本研究通過I.DOT檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，低葉酸環(huán)境中DTG使胚胎葉酸攝取效率下降46%，導(dǎo)致神經(jīng)管閉合關(guān)鍵基因如Pax3、Shh表達(dá)異常，最終引發(fā)露腦畸形。正常葉酸組血清葉酸均值6.89±2.28ng/mL，足以補(bǔ)償DTG的受體拮抗作用，而低葉酸組波動(dòng)幅度達(dá)2.6ng/mL，為正常組1.3倍，使部分胚胎落入“葉酸匱乏閾值”，激活致畸通路。
臨床對(duì)照上，博茨瓦納未實(shí)施葉酸強(qiáng)化，2018年DTG相關(guān)NTD風(fēng)險(xiǎn)0.94%，隨著葉酸補(bǔ)充推薦，2022年風(fēng)險(xiǎn)降至0.19%，與實(shí)驗(yàn)中“低葉酸組風(fēng)險(xiǎn)隨葉酸水平升高而下降”一致 [8,9]；葉酸強(qiáng)化國家如美國，人群血清葉酸均值提升35%，使用DTG時(shí)NTD發(fā)生率仍維持0.09%基線水平，驗(yàn)證“葉酸充足可阻斷DTG致畸”。技術(shù)價(jià)值上，I.DOT僅需5μL臨床樣本即可檢測(cè)，解決傳統(tǒng)方法樣本耗竭問題，且憑借高通量（100+樣本/天）與低CV（<5%），成功捕捉低葉酸組0.415%的NTD發(fā)生率，為罕見致畸事件研究提供可靠工具。
在技術(shù)價(jià)值層面，I.DOT技術(shù)憑借微量樣本精準(zhǔn)檢測(cè)能力（僅需5μL血清即可完成檢測(cè)），有效解決了傳統(tǒng)方法中珍貴臨床樣本耗竭的難題，尤其適用于孕婦血清等稀缺樣本的葉酸代謝分析；其高通量（100+樣本/天）與低變異系數(shù)（CV<5%）特性，成功捕捉到低葉酸組0.415%的罕見神經(jīng)管缺陷（NTD）發(fā)生率——這一精度遠(yuǎn)超傳統(tǒng)方法（易因誤差漏檢），為發(fā)育毒理學(xué)研究中低概率致畸事件的量化分析提供了可靠工具。
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