HEK293細胞系，作為生物制藥和學(xué)術(shù)界的明星細胞，以其快速繁殖、易于維護和轉(zhuǎn)染能力而備受青睞。HEK293細胞系是瞬時穩(wěn)定蛋白生產(chǎn)的可靠資源，作為病毒載體在基因和細胞治療中有用。多年來廣泛用于生產(chǎn)工業(yè)和研究級蛋白，近年也成基因和細胞治療發(fā)展支柱。目前，F(xiàn)DA 和 EMA 已批準5種用其生產(chǎn)的治療藥物及6種用其衍生物產(chǎn)生病毒載體的細胞和基因療法。學(xué)術(shù)研究人員常用其建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞系，研究信號通路和受體配體等。現(xiàn)在，CYTENA BPS帶來了C.BIRD?微型生物反應(yīng)器技術(shù)，為這一重要細胞系的生長和蛋白生產(chǎn)帶來了突破性的提升。
CYTENA公司的 C.BIRD 微型生物反應(yīng)器為細胞培養(yǎng)帶來了新的可能。之前的研究已經(jīng)表明它能提升懸浮型CHO細胞系的生長和蛋白生產(chǎn)，這次研究發(fā)現(xiàn)它對貼壁的 HEK293 細胞在96孔和24孔板培養(yǎng)中也有顯著效果。
研究選用了表達單克隆抗體（mAb）的 HEK293 細胞系，在含有10%胎牛血清、青霉素-鏈霉素和100 μg/mL 潮霉素B的Minimum Essential Medium（MEM）中培養(yǎng)，培養(yǎng)環(huán)境為 37°C、5% CO?。使用了標準的24孔板和96孔板，同時設(shè)置了傳統(tǒng)靜態(tài)培養(yǎng)和C.BIRD混合培養(yǎng)兩種方式進行對比。細胞初始濃度分為低初始密度（1x10? cells/cm2）和高初始密度（1x10? cells/cm2）兩組。
在 C.BIRD 混合培養(yǎng)組中，細胞先在靜態(tài)條件下培養(yǎng) 24 小時，然后以50 秒/周期的混合速率在C.BIRD系統(tǒng)中連續(xù)混合培養(yǎng)。在指定時間，收集細胞培養(yǎng)上清液測定蛋白產(chǎn)量，用 0.25% 胰蛋白酶消化收集細胞，用TC20自動細胞計數(shù)器測量總細胞密度、活細胞密度和細胞活力，蛋白產(chǎn)量通過 IgG（Total）Human Uncoated ELISA Kit 測量，并計算蛋白倍數(shù)變化，進行多重未配對t檢驗。
對比實驗設(shè)計如圖1所示。采用靜態(tài)培養(yǎng)法和C.BIRD培養(yǎng)法測定表達HEK293細胞的總細胞密度、活細胞密度和蛋白產(chǎn)量。
圖1. 實驗設(shè)計示意圖
結(jié)果顯示，在96孔板測試中，第8天C.BIRD培養(yǎng)組的平均總細胞密度和活細胞密度分別達到3.29和 3.12x10? cells/cm2，而靜態(tài)培養(yǎng)組僅為1.40和1.29x10? cells/cm2（圖2A,2B），且兩組細胞的活力到第8天均保持在90%以上（圖2C）。測量天數(shù)內(nèi)，C.BIRD 培養(yǎng)組的平均蛋白產(chǎn)量是靜態(tài)培養(yǎng)組的2倍多（圖2D）。
24 孔板測試結(jié)果類似，第8天C.BIRD組的總細胞密度和活細胞密度平均值分別為3.01和2.83×10?/cm2，幾乎是靜態(tài)培養(yǎng)組的3倍（圖2E,2F），兩組細胞存活率均維持在90%以上，直至第8天（圖2G），蛋白產(chǎn)量也比靜態(tài)培養(yǎng)方法提高了2倍（圖2H）。
靜態(tài)培養(yǎng)法和C.BIRD培養(yǎng)法在96孔板和24孔板上的細胞融合度如圖3所示。兩組的培養(yǎng)液中幾乎都沒有發(fā)現(xiàn)漂浮的死細胞。然而，在顯微鏡下觀察兩組細胞密度的差異是明顯的。C.BIRD培養(yǎng)組細胞比靜態(tài)培養(yǎng)組細胞更致密。這一結(jié)果與圖2所示的細胞密度量化有關(guān)。
圖2. A-D)低初始密度試驗96孔板培養(yǎng)條件下細胞總密度、活細胞密度、細胞活力和蛋白產(chǎn)量。E-H)低初始密度試驗時24孔板培養(yǎng)條件下的細胞總密度、活細胞密度、細胞活力和蛋白產(chǎn)量。數(shù)據(jù)以mean±SD表示。
圖3. 低初始密度培養(yǎng)條件下表達HEK293細胞的單抗在96孔板和24孔板的亮場顯微鏡圖像。在指定時間觀察靜態(tài)組和C.BIRD培養(yǎng)組。比例尺= 1mm。
在高初始密度試驗中，細胞播種密度為1x105個/cm2。結(jié)果與低初始密度試驗的趨勢一致。在96孔板測試中，第3-5天，C.BIRD培養(yǎng)組的平均總細胞密度和活細胞密度分別達到3.28x10? cells/cm2和3.16x10? cells/cm2，是靜態(tài)培養(yǎng)組的2.2 倍（圖4A,4B），細胞活力到第5天均保持在90%以上（圖4C），蛋白產(chǎn)量在第5天將近是靜態(tài)培養(yǎng)組的4倍（圖4D）。24 孔板測試中，C.BIRD培養(yǎng)方法也提高了總細胞密度和活細胞密度（圖4E,4F），每組細胞活力到第5天保持在90%以上（圖4G），第3-5天C.BIRD培養(yǎng)組的蛋白產(chǎn)量顯著高于靜態(tài)培養(yǎng)組（圖4H）。
高初始密度試驗的細胞融合性結(jié)果與低初始密度試驗的結(jié)果相似。鏡下觀察，兩組培養(yǎng)液中均未見漂浮死細胞。此外，C.BIRD培養(yǎng)組的細胞比靜態(tài)培養(yǎng)組更致密（圖5）。
圖4. A-D)高初始密度試驗96孔板培養(yǎng)條件下細胞總密度、活細胞密度、細胞活力和蛋白產(chǎn)量。E-H)高初始密度試驗時24孔板培養(yǎng)條件下的細胞總密度、活細胞密度、細胞活力和蛋白產(chǎn)量。數(shù)據(jù)以mean±SD表示。
圖5. 高初始密度培養(yǎng)條件下表達HEK293細胞的單抗在96孔板和24孔板的亮場顯微鏡圖像。在指定時間觀察靜態(tài)組和C.BIRD培養(yǎng)組。比例尺= 1mm。
C.BIRD 混合培養(yǎng)顯著提高了 HEK293 細胞系在96孔和24孔板中的細胞密度和蛋白產(chǎn)量，能夠縮短獲得足夠細胞數(shù)量和蛋白分泌所需的培養(yǎng)時間，這對生物制品生產(chǎn)、細胞療法和基因療法等使用HEK293細胞系及其衍生物的過程具有潛在的加速作用。
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