在生物生產領域，單克隆性是至關重要的，它要求細胞來自單個細胞且具有遺傳同質性。傳統的單細胞克隆方法，如有限稀釋法，是基于泊松統計概率來估計單克隆性的；這種方法存在諸多弊端，它不僅耗時、通量低，而且需要細胞擴增來確定理想的候選細胞。此外，由于有限稀釋可能導致每個孔中有多個細胞，所以往往需要多輪克隆來提高單克隆性的概率[1-3]。
NanoCellect Biomedical, Inc.推出的WOLF G2流式細胞分選儀，它們能夠篩選數百萬個細胞，并根據多達11個參數對感興趣的細胞進行特異性分選和單細胞分配，從而滿足細胞系開發的需求。本文使用了一種常見的熒光參數—活力染料，來提高細胞的生長。DRAQ7就是一種用于檢測細胞活力的遠紅色生物標志物，它可以與細胞膜受損細胞中的雙鏈DNA（dsDNA）結合 [4,5]。利用配置有488nm和637nm雙激光的WOLF G2來分選帶有DRAQ7的GFP + HEK293細胞，可以完全排除死細胞，在進行單細胞克隆時最大化鋪板密度和細胞的生長[6]。
鞘液和樣品緩沖液由1xPBS、0.5% BSA、5mM EDTA和12.5mM HEPES組成。實驗設置了多個對照組，包括未染色的HEK293T陰性對照、用DRAQ7染色的活：死（50:50）HEK293T對照以及GFP + HEK293對照。用于分選的樣品中含有75%的HEK293T和25%的GFP + HEK293T細胞，并用DRAQ7染色，最終濃度為1.0x10?cells/mL。
在分析過程中，應用補償來創建一個矩陣（圖1）。將帶有細胞門的散點圖應用于FSC-H與FSC-width圖以創建單線門。單線門應用于雙變量圖（DRAQ7 vs FITC）。
圖1. 基于DRAQ7和GFP標記的細胞分選結果分布圖
將細胞分選到預先填充有200 uL完整克隆培養基的三個96孔板中，同時準備一個采用有限稀釋法（1.0細胞/孔）的96孔板作為對照。這些板在37°C、5% CO?的環境中培養，并在第0天使用酶標儀的綠色熒光通道檢測可能生長成菌落的GFP+細胞。在第7天和第14天，使用明場和綠色熒光通道確認菌落形成并確定細胞生長情況。而且，這個實驗重復了三次，每次都使用不同的無菌WOLF分選盒和流體系統。
1、在總體生長情況上，使用配置637nm激光的WOLF G2對帶有DRAQ7的GFP+ HEK293細胞進行單細胞分選以排除死細胞時，觀察到平均總生長率為81±3.9%，相比有限稀釋法的20±8.1%，提高了約4倍（圖2）。
圖2. 14天后HEK293 GFP的平均總生長量：與有限稀釋法相比，使用WOLF G2用于單細胞集落時，觀察到生長量增加了4倍。
2、在單克隆生長情況方面，在第0天、第7天和第14天對96孔培養板進行分析時，確認WOLF G2導致了74±2.9%的單克隆生長，與有限稀釋法制備的板中20±7.6%相比，提高了3.75倍（圖3）。
圖3. 與有限稀釋法相比，使用WOLF G2進行單細胞克隆時的平均單細胞沉積：與極限稀釋相比，用于單細胞克隆的WOLF G2產生了3.75倍的孔，其中含有源自單個細胞的單個菌落。
3、單克隆性通過在第0天、第7天和第14天使用Celigo分析細胞，追溯確認檢測到的顆粒實際上是細胞，并通過觀察它們生長成菌落來驗證單克隆性。同時，多天的測量也確保了含有菌落的孔確實來自單個細胞（圖4）。
圖4. 在第0天、第7天和第14天顯示單細胞生長的代表性孔：在使用WOLF G2和N1進行單細胞分選時，第0、7和14天用于確定菌落是否來自沉積在孔中的單個細胞。注意細胞如何保持在相同的位置，并隨著細胞的生長而增大。
4、總生長結果與我們之前使用WOLF在沒有活性染料的情況下對GFP+ HEK293細胞進行分選的結果一致。先前研究的平均總生長為78±5.5%（圖5）[7]。
圖5. 與WOLF、WOLF G2和有限稀釋法相比，HEK293 GFP的平均總產出量在范圍內，無論使用哪種WOLF。由于能夠產生更多的單細胞克隆，使用WOLF的單細胞分選優于限制稀釋。
這項研究表明，WOLF G2與傳統的有限稀釋法等方法相比，能夠確保更高的單克隆性。而且，WOLF G2還有多種激光配置可供選擇，如488-405nm和488-561nm等，可用于各種遺傳標記、常規染料和新興化學物質，以滿足細胞系的開發以及其他克隆或樣品制備工作流程的需求。
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