蛋白會經歷各種翻譯后修飾（PTMs). 這些修飾能夠使得蛋白的活性，定位，相互作用和穩定性得到非常精細的調節。與蛋白的磷酸化具有相似的復雜性和重要性，賴氨酸殘基的ε-amine的乙酰化，成為最普遍存在的蛋白翻譯后修飾的一種。賴氨酸乙酰化是由賴氨酸乙酰基轉移酶（KATs)誘導，由去乙酰化轉移酶(KDACs）去除乙酰化。除了乙酰基之外，還可以添加和移除更長的酰基鏈，包括丙酰基、丁酰基和肉豆蔻酰基，或者由二羧酸（如丙二酸、琥珀酸或谷氨酸酸）衍生出的酰基團，上述的賴氨酸修飾酶能夠完成這一過程。

人類的基因組中已鑒定出18種不同的KDACs，根據它們的序列同源性分成四組。Sirtuins, 屬于第三類KDACs,是KDAC家族中比較特殊的成員。雖然一類，二類和四類去乙酰化酶是Zn2+依賴的金屬蛋白酶型的去乙酰化酶，但是7種人的sirtuins亞型為NAD+依賴的催化機制。在催化反應過程中，sirtuins會經歷一種構象變化過程，從無酶活的“開放構象”轉變為（假）底物結合態的“封閉構象”。Sirt2亞型主要位于細胞質，能夠將多種底物去乙酰化，例如α-tubulin, BubR1, p53, eIF5A和NFκB。Sirt2依賴的去乙酰化對細胞周期調節，自噬，周緣髓鞘化和免疫及炎癥應答存在主要的影響。除了去乙酰化，Sirt2也催化長鏈脂肪酸的去除。然而，越來越多的研究報道發現，Sirt2的總體細胞作用機制不僅僅依賴于催化活性，也依賴于蛋白和蛋白之間的相互作用，比如KDA6或TTTP/p25。

Sirt2的功能失調和多種疾病的發生相關，包括細菌感染，類型II糖尿病，神經退行性疾病和腫瘤，提示Sirt2有希望成為一個藥物干預的靶點。然而，對于一些疾病，包括亨廷頓氏病以及一些類型的腫瘤，還未最終被明確Sirt2是被上調，還是被下調或者被抑制，進而改善特定的疾病狀態。由于迫切需要合適的工具化合物來進一步研究 Sirt2 去乙酰化對細胞的影響，并驗證 Sirt2 作為藥物靶點的潛力，因此人們發現了多種具有藥物特性的 Sirt2 選擇性小分子抑制劑。最近，我們已經發現了一類新的Sirt2高度選擇性抑制劑（請見Figure 1A).這些化合物在較低的uM到nM濃度范圍內抑制Sirt2, 然而對于它的相近的同源物Sirt1和Sirt3卻沒有檢測到抑制效應（IC50>100uM)。

Sirt2與1或2結合形成的復合物結構（請見Figure 1A）是 Sirt2與特異性Sirt2 抑制劑結合的首個晶體結構。這些數據表明抑制發生的特定模式，一旦配體結合，Sirt2的激活位點會出現重大改變（請見Figure 1B)。由于激活位點的結構重排，鉸鏈區的兩個環會形成一個新的結合口袋，該結合口袋將羅森曼折疊域與鋅離子結合域連接了起來。這種現象僅在Sirt2中被觀察到，并且其原因歸結于Sirt2在活性位點這一特定區域所具有的獨特靈活性。因此這種類型的抑制劑被稱為Sirtuin重排配體（SirReals），形成的誘導-契合結合口袋被稱為選擇性位點。因為經鑒定，它是Sirt2選擇性的關鍵。在我們發現Sirt2的選擇性口袋存在的不久后，研究結果表明，這個小囊腔能夠容納一種名為“肉豆蔻酰基”底物的長鏈脂肪酸。同時，其他 Sirt2 抑制劑通過與選擇性凹槽結合的方式實現了其亞型選擇性。

因此，我們的目的是研究SirReal-Sirt2相互作用的結合動力學。最初嘗試利用ITC檢測結合和解離動力學，但未能成功，這可能與以下事實有關：結合焓值被與重排過程相關的能量貢獻所掩蓋了。因此，我們將一個經丙炔基化處理的 SirReal 類似物與一個氨基官能化的生物素進行連接，從而得到了一種具有三唑連接的源自 SirReal 的親和探針。該探針在BLI中用于結合動力學研究。我們的動力學結果顯示一個非常慢的解離動力學（請見Figure 1C)，表明Sirt2在配體結合后，Sirt2的活性位點確實捕獲了SirReal,導致構象發生適應性改變。這導致了配體在靶點上的較長的滯留時間（例如配體-復合物的半衰期）以及造成的慢的解離（請見Figure 1C).然而，Sirt2與基于三唑的 SirReal 形成的復合物的共晶體結構表明，三唑部分，在標記過程中，做為連接部分被引入，也涉及到通過特定的方式與Sirt2相結合。三唑部分與共因子結合環的第97位精氨酸形成氫鍵（請見Figure 1B).為了闡明，Sirt2的親和探針較長的結合時間是由于三唑部分引入引起的，還是僅僅由于SirReal的結合，我們需要尋找一種新的技術，通過無標記技術檢測該結合動力學。

SirReal與Sirt2的結合動力學

為了通過配體無標記法研究Sirt2-SirReal結合動力學（Kon, Koff常數），我們利用了以DNA納米桿為特征的switchSENCE技術。該方法具有較高的靈敏度，用以檢測未標記的小分子和表面偶聯蛋白的相互作用。在我們的實驗設計中，Sirt2經共價偶聯到短的雙鏈DNA納米桿的一條鏈上，該DNA納米桿與金屬微電極連接。另一條鏈使用熒光染料標記，本文使用的是Cy3（請見Figure 2A).通常，該設計可通過兩種模式測量。在靜止模式下，配體與DNA納米桿上的蛋白相互作用直接通過DNA納米桿上的熒光信號發射進行表征。然而，值得提到的是，如果結合不能夠直接影響與DNA連接的熒光探針的熒光特性，就無法利用該模式檢測。在SirReal-Sirt2相互作用下，靜止模式的測量未能產生任何結合數據可以用于進一步分析。因此，我們使用了動力學模式，檢測SirReal-Sirt2的相互作用。switchSENCE技術在金屬電極表面產生正負交替變換的電壓，能夠吸引或排斥雙鏈DNA帶有負電荷的骨架。這使得DNA納米桿產生了一個方向上的擺動，被稱為“switching”。由于存在一種與距離相關的無輻射能量傳遞方式，使得染料所發出的熒光光強能夠反映其與金表面的距離。換句話說，熒光團與猝滅金表面的距離越近，發出的光就越少。改變偶聯蛋白的流體摩擦力的過程（比如配體結合，構象重構，熱變性）都會影響DNA運動的速度，這導致在擺動的動力學上發生變化。

在進行動力學測量之前，我們想要闡明，固定的過程是否會影響Sirt2結構的完整性以及配體結合的性能。因此，我們在SirReal2存在和不存在時，分別測量了偶聯的Sirt2的熱穩定性（請見Figure 2B).通過 SirReal2對Sirt2 進行的固定化處理，即使是在低微摩爾濃度的配體存在下，也能實現其熱穩定性，這表明其折疊狀態良好且具有有效的配體結合特性。附著的Sirt2的熱穩定性與濃度和時間均相關（請見Figure 2B)。

需要注意的是，通過switchSENCE技術可以發現，在配體濃度為3.3-10uM之間，出現了顯著的熱轉移（?T ~ 3 °C）。使用結合到附著的Sirt2上的SYPRO熒光染料進行熒光熱轉移檢測，僅僅在25uM的高配體濃度下可檢測到相似的熱轉移（?T ~ 3 °C）。

根據熱穩定檢測結果，我們在配體濃度為2-20uM之間，檢測動力學。通過采用 switchSENSE® 技術（動態模式），我們觀察到未標記的 SirReal2從固定化的 Sirt2 上發生了非常緩慢的解離（請見Figure 2C）。此外，對不同濃度的SirReal2(2.2uM-20uM), 我們獲得了該相互作用的結合常數 kon ，解離常數 koff 以及 K d 值，其數值與之前報道的 Sirt2與我們所使用的標記并固定化的 SirReal 基質親和探針之間相互作用的數據在范圍上高度相似（kon = 6.9 ± 0.22 × 10 3 M-1 s-1 , koff = 7.0 ± 0.31 × 10 -4 s-1 , K d = 0.10 μM)。通過對記錄的數據進行分析，我們得到了相互作用的常數kon =7.7 ± 0.2 × 10 2 M-1 s-1 , koff = 4.1 ± 0.1 × 10 -4 s-1。該數據為我們提供了總的解離常數Kd=Koff/Kon=0.53±0.02uM. 這個K d 值與已報道的 SirReal2 的 IC 50值高度一致，IC50值為0.44uM。

為了進一步驗證SirReals較長的結合時間是配體本身的特性決定，并非是由于三唑與第97位精氨酸形成的H-鍵的相互作用引起，我們利用 switchSENSE® 技術確定了含三唑結構的 SirReal 類似物 5 的動力學參數。獲得的Koff常數為7.9 ± 0.6 ×10 -4 s -1 ，與含三唑結構的 SirReal的親和探針獲得的Koff較一致koff = 7.0 ± 0.31 × 10 -4 s-1，以及與由BLI和switchSENCE測得的SirReal2結合常數4.1 ± 0.1 × 10 -4 s-1也較一致。因此我們能夠表明，SirReal-Sirt2相互作用較長的結合時間是來自于SirReal本身的特性，既不是三唑結構引入的結果，也不是測量技術的偏差。

無標記switchSENCE技術檢測SirReal2與Sirt2結合動力學