球體培養是一種體外三維細胞培養系統，它能提供細胞間以及細胞與細胞外基質（ECM）的相互作用網絡，通過信號傳導來維持細胞表型。它突破了在體外重現體內微環境的限制，正逐漸成為藥物開發（包括藥物篩選和癌癥研究）的強大工具。球體培養能夠模擬實體瘤中藥物、營養物質、氧氣和代謝物的擴散受限分布，而二維單層培養則無法做到這一點。球體培養架起了從傳統二維培養到體內動物模型之間的信息橋梁，是制藥和生物領域中可靠且廣泛使用的方法。

盡管球體培養適合高通量篩選，并且可以在多孔板中進行規模放大，但在生成高質量球體方面仍存在局限性。我們在此展示了利用 C.BIRD 微生物反應器（圖 1A）進行大量球體培養的創新培養方法。C.BIRD 由一個自主控制單元和一個帶有 24 或 96 個流體通道的 C.BIRD 蓋子組成（圖 1B）。在本研究中，我們使用超低附著（ULA）圓底板對人結腸癌細胞系 HCT116 進行球體形成分析（圖 1C）。將培養板轉移到 C.BIRD 設備后，蓋子的氣動連接提供了低剪切力可調混合，以實現培養均勻化（圖 1D）。通過使用這種特定的培養系統，我們證明了與靜態培養形成的球體相比，球體形成和細胞健康維持有了顯著改善。我們的新技術為優化球體培養環境提供了思路，并克服了生成高質量球體的障礙。

圖2  比較在 96 孔超低附著板中靜態培養和 C.BIRD 培養條件下結腸癌 HCT116 球體的生長情況和細胞健康狀況。（A）在顯微鏡下觀察 HCT116 腫瘤細胞系從第 3 天到第 10 天形成的球體形態。比例尺 = 0.5 毫米。（B）在 10 天內評估球體的生長動力學、圓度和圓整度。使用 ImageJ 軟件進行分析，數據代表每組六個重復樣本的平均值 ± 標準誤。（C 和 D）使用 PrestoBlue 細胞活力試劑評估球體細胞健康狀況。在球體培養 6、7 和 10 天后，向每個孔中加入 20 微升 PrestoBlue 細胞活力試劑，然后在 37°C 和 5% CO₂ 條件下再孵育 3 小時，之后在基于熒光的微孔板讀數儀（激發/發射波長約為 560/590 納米）上讀取。細胞活力通過每個組的六個重復樣本的熒光信號來測量。熒光信號通過球體直徑進行標準化；較高的比率（熒光/直徑）表明球體更健康。P 值的顯著性列為：P ≤ 0.01（**），P ≤ 0.001（***）和 P ≤ 0.0001（****）。數據以平均值 ± 標準誤表示。

由 500 個細胞形成的球體在第 3 天的直徑約為 0.35 毫米，比靜態培養組和 C.BIRD 培養組中由 1000 個細胞形成的球體要?。▓D 3A）。然而，第 6 天 C.BIRD_500 球體的直徑、圓度和圓整度（0.7634 毫米）與 Static_1000 球體（0.7569 毫米）相似（圖 3A 和 3B）。此外，第 6 天 C.BIRD_500 球體的細胞健康狀況甚至優于 Static_1000 球體（圖 3C 和 3D）。

通過使用 Calcein AM、NucBlue Live ReadyProbes 試劑和 DRAQ7 染色進一步評估了第 6 天球體的細胞活力。Calcein AM 和 NucBlue Live ReadyProbes 試劑（Hoechst 33342）用于標記活細胞。DRAQ7 是一種蒽醌化合物，可對死亡和通透性細胞的細胞核進行染色。

陽性對照中，球體用 4%多聚甲醛固定，作為死細胞。使用 Opera Phenix 高內涵篩選系統以共聚焦模式對球體的熒光進行成像（圖 4A、4B 和 4C）。該圖像是沿 Z 軸每隔 10 微米拍攝的 31 張圖像的最大強度投影，拍攝范圍為 300 微米，使用 10×物鏡。對每個細胞的熒光進行測量并量化為平均強度。Calcein AM/NucBlue Live（活細胞）的平均熒光強度在靜態培養和 C.BIRD 培養之間沒有顯著差異。即使 C.BIRD_1000 的球體大小也大于 Static_1000，C.BIRD_1000 組中 DRAQ7（死細胞）的平均強度也沒有顯著升高（圖 4D）。這些結果表明，即使在較低的細胞接種密度下，C.BIRD 培養方法生成的球體在質量和數量上也與靜態培養相似。

圖 3  通過不同的細胞接種密度評估球體形態和細胞健康狀況：靜態培養中每孔 1000 個細胞（Static_1000）；C.BIRD 培養中每孔 1000 個細胞（C.BIRD_1000）以及 C.BIRD 培養中每孔 500 個細胞（C.BIRD_500）。(A) 在第 3 天和第 6 天通過顯微鏡觀察球體的細胞形態；比例尺 = 250 微米。(B) 在第 3 天和第 6 天測量球體生長動力學。在 6 天內評估球體的圓度和圓整度。使用 ImageJ 軟件進行數據分析，并以每組六個重復實驗的平均值 ± 標準誤表示。(C 和 D) 在第 6 天使用 PrestoBlue 細胞活力試劑評估球體細胞健康狀況。然后向每個孔中加入 20 微升 PrestoBlue 細胞活力試劑。隨后將球體在 37°C 和 5% CO₂ 條件下孵育 3 小時，并在熒光微孔板讀數儀上讀取熒光值（激發/發射波長約為 560/590 納米）。每組的活力通過六個重復樣本的熒光信號來測量。熒光信號通過球體直徑進行標準化；熒光與直徑的比值越高，表明球體越健康。P 值的顯著性標注如下：P ≤ 0.01（**），P ≤ 0.001（***）和 P ≤ 0.0001（****）。數據以平均值 ± 標準誤的形式展示。

圖 4  采用 Calcein AM 染料、NucBlue Live ReadyProbe 試劑和 DRAQ7 染料對球體細胞活力進行評估。球體培養 6 天后，將 Calcein AM 和 NucBlue Live ReadyProbe 試劑加入培養板，孵育 30 分鐘，然后用半體積的杜爾貝科磷酸鹽緩沖鹽水（DPBS）沖洗至少三次。接著向培養板中加入 DRAQ7 染料，在 37°C 下孵育 10 分鐘，再用 DPBS 沖洗，并使用 Opera Phenix 高內涵篩選系統進行成像。用 4%多聚甲醛固定的球體作為死細胞的陽性對照。（A-C）活細胞染色后在細胞質中發出綠色熒光（A），在細胞核中發出藍色熒光（B）。死細胞染色后發出紅色熒光（C）。比例尺 = 200 微米。（D）使用 Opera Phenix 高內涵篩選系統的軟件對掃描區域和強度進行分析。數據以平均值 ± 標準誤表示，每個實驗重復三次。*P < 0.05 與 Static_1000 球體相比。

盡管在藥物研發方面投入巨大，但新抗癌藥物的獲批率仍低于 5%。由于腫瘤的復雜性，三維培養腫瘤球體的技術被廣泛用于研究藥物活性，并已被證明比單層細胞培養更接近臨床腫瘤的病理生理特征，且成本更低，動物實驗更少。提高新藥研發成功率的一種策略是利用腫瘤球體進行高通量藥物篩選。優化球體培養對于生成高質量的球體以供醫學領域使用至關重要。在我們的研究中，C.BIRD 培養的球體生長速度高于 ULA 板中靜態培養的球體（圖 2）。C.BIRD 培養的球體在第 6 天和第 7 天的細胞健康狀況也優于靜態培養的球體（圖 2）。此外，在相同的接種密度下，C.BIRD 培養的球體在第 7 天的大小與靜態培養的球體在第 9 天的大小大致相同（圖 2），并且 C.BIRD 培養中的球體細胞健康狀況優于靜態培養中的球體細胞（圖 3）。

總之，我們的研究結果有兩個主要意義：（1）C.BIRD 培養方法通過使用 ULA 板在無血清培養基中改善了腫瘤球體的生長；（2）C.BIRD 混合培養延長了球體的存活時間。這意味著 C.BIRD 文化方法是優化腫瘤球體 3D 文化的一個更好的選擇，并且能夠改進藥物篩選工作流程，從而在細胞活力/細胞毒性檢測中獲得更準確的結果。