在生物制藥領(lǐng)域，細(xì)胞株開發(fā)（CLD）是生物制品研發(fā)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，而單細(xì)胞克隆（SCC）作為生成穩(wěn)定蛋白生產(chǎn)細(xì)胞系的重要步驟，卻面臨著勞動密集和耗時的挑戰(zhàn)。優(yōu)化 SCC 流程，對于加速新生物制品的上市進(jìn)程、降低成本具有深遠(yuǎn)意義。過去幾十年，治療性生物制品市場迅速增長，預(yù)計2025年全球市場收入將達(dá)約3000億美元，其中單克隆抗體（mAb）占比頗高[1]。哺乳動物細(xì)胞，尤其是CHO細(xì)胞系，因易于培養(yǎng)、產(chǎn)量高、翻譯后修飾有效、人源兼容且獲FDA批準(zhǔn)等優(yōu)勢，成為生物制品生產(chǎn)的主流細(xì)胞系。
CLD是生物制品開發(fā)的關(guān)鍵步驟，旨在從SCC中找到高產(chǎn)細(xì)胞系，但該流程勞動密集且耗時長久。在SCC流程中，生物制藥公司必須遵循FDA和歐洲藥品管理局規(guī)定以證明生產(chǎn)細(xì)胞系的克隆性[2,3]，常用方法包括有限稀釋、熒光激活細(xì)胞分選（FACS）和單細(xì)胞分配等。本研究中，我們采用CYTENA的 F.SIGHT? 2.0 單細(xì)胞分配器和C.BIRD?微生物反應(yīng)器，聚焦CLD 中的SCC流程優(yōu)化，尤其是在細(xì)胞克隆早期階段，以加速 CLD進(jìn)程，降低成本，提高效率。單細(xì)胞分配器不僅保證了細(xì)胞分配器的單克隆性，而且具有較高的細(xì)胞存活率和克隆效率[4]。
我們的夏令營覆蓋了廣泛的科技領(lǐng)域，包括計算機(jī)編程、機(jī)器人技術(shù)、3D打印、無人機(jī)應(yīng)用等。我們的課程由一支擁有豐富經(jīng)驗(yàn)與知識的導(dǎo)師團(tuán)隊授課，他們將為孩子們提供個性化的指導(dǎo)和輔導(dǎo)，使孩子們能夠更好地理解和掌握科技知識。
本研究選用表達(dá)mAb的CHO-S細(xì)胞系，在添加特定成分的 CD Hybridoma Medium 中培養(yǎng)。
分別使用標(biāo)準(zhǔn) 96 孔板和 24 孔板進(jìn)行 C.BIRD?培養(yǎng)和靜態(tài)培養(yǎng)，搖瓶培養(yǎng)則在特定轉(zhuǎn)速的軌道搖床中進(jìn)行，所有培養(yǎng)均在 37°C、5% CO?水套培養(yǎng)箱中連續(xù)培養(yǎng)3天。
96孔板對比測試中，設(shè)置不同初始細(xì)胞密度（1×104, 1.5×104, 2×104和3×104細(xì)胞/孔），C.BIRD?混合模式為連續(xù)模式，混合速率 50秒/循環(huán)。24 孔板對比測試中，同樣設(shè)置不同初始細(xì)胞密度（5×104, 1×105, 2×105和5×105細(xì)胞/孔），C.BIRD?混合模式為連續(xù)模式，混合速率25秒/循環(huán)。培養(yǎng)4天后計數(shù)細(xì)胞數(shù)量和活力。
運(yùn)用 F.SIGHT? 2.0 將單細(xì)胞分配至96孔和384孔板，使用EX-CELL CHO Cloning Medium，96孔板的每孔體積為200 μL， 384孔板的每孔體積為80 μL。F.SIGHT? 2.0 通過高分辨率成像實(shí)現(xiàn)單細(xì)胞的全自動分離和熒光分選。將CHO-S細(xì)胞稀釋至5×105個/mL，將50 μL細(xì)胞懸液裝入培養(yǎng)皿。分配器芯片快速生成小液滴，在運(yùn)行過程中對噴嘴區(qū)域進(jìn)行連續(xù)成像，確認(rèn)液滴為單個細(xì)胞，參數(shù)正確。然后將這些經(jīng)過驗(yàn)證的細(xì)胞分配到選定的孔中（圖1）。
比較靜態(tài)、搖板和C.BIRD?微反應(yīng)器培養(yǎng)方法對細(xì)胞生長率的影響（圖2）。所有細(xì)胞在37℃和5% CO2條件下培養(yǎng)。96孔組細(xì)胞經(jīng)單細(xì)胞分配后，靜態(tài)培養(yǎng)14天，再轉(zhuǎn)移到24孔板繼續(xù)培養(yǎng)4天；搖板組在96孔板靜態(tài)培養(yǎng)后，轉(zhuǎn)移到搖板培養(yǎng)；C.BIRD組則在96孔板靜態(tài)培養(yǎng)10天后，用C.BIRD微反應(yīng)器培養(yǎng)4天，再轉(zhuǎn)移到24孔板繼續(xù)C.BIRD培養(yǎng)。384孔組在單細(xì)胞分配后靜態(tài)培養(yǎng)10天，然后轉(zhuǎn)移到96孔板繼續(xù)培養(yǎng)，其中C.BIRD組使用C.BIRD微反應(yīng)器。在單細(xì)胞分配后的第14天和第18天，使用細(xì)胞計數(shù)器測量細(xì)胞密度和活力。
圖2. 克隆擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)設(shè)計示意圖。(A)單細(xì)胞克隆流程從96孔平板培養(yǎng)開始。(B)單細(xì)胞克隆流程從384孔平板培養(yǎng)開始。
96孔板培養(yǎng)結(jié)果顯示，接種密度為不同數(shù)值時，C.BIRD?培養(yǎng)在第天的活細(xì)胞數(shù)量顯著高于靜態(tài)培養(yǎng)，隨著接種細(xì)胞數(shù)增加，C.BIRD?培養(yǎng)的活細(xì)胞數(shù)的優(yōu)勢明顯，且各組細(xì)胞活力均維持在85%以上（圖3A）。
24孔板培養(yǎng)結(jié)果顯示，不同接種密度下，C.BIRD?培養(yǎng)在第4天的活細(xì)胞數(shù)量同樣高于靜態(tài)培養(yǎng)，C.BIRD?培養(yǎng)各接種密度的細(xì)胞活力多維持在90%以上，而靜態(tài)培養(yǎng)在高接種密度時細(xì)胞活力有所下降（圖3B）。結(jié)果表明，C.BIRD?微生物反應(yīng)器在低接種密度下顯著提升細(xì)胞生長，在96孔板中細(xì)胞生長提升約 2.1-2.7倍，24孔板中提升約1.3-1.8倍，且不影響細(xì)胞活力。
圖3. 靜態(tài)培養(yǎng)和C.BIRD培養(yǎng)的活細(xì)胞數(shù)和細(xì)胞活力。(A) 96孔平板培養(yǎng)，C.BIRD混合條件為連續(xù)50秒/循環(huán)。(B)對于24孔平板培養(yǎng)，C.BIRD混合條件為連續(xù)25秒/循環(huán)。
96 孔板接種單細(xì)胞并培養(yǎng)10天后，C.BIRD?培養(yǎng)組在部分細(xì)胞達(dá)到 5% 匯合度時應(yīng)用反應(yīng)器（圖4A），結(jié)果顯示，C.BIRD組在96孔板中靜態(tài)培養(yǎng)10天后，以50秒/周期的連續(xù)混合模式使用C.BIRD微反應(yīng)器培養(yǎng)4天。第14天，C.BIRD組的平均活細(xì)胞數(shù)是靜態(tài)培養(yǎng)的兩倍，達(dá)到1.94×105個細(xì)胞/孔（圖4B），細(xì)胞活力分別為91.4%、88.8%和94.1%（圖4C）。繼續(xù)培養(yǎng)至第18天，C.BIRD組的細(xì)胞數(shù)達(dá)到1.56×106個細(xì)胞/孔，比其他組高出1.6倍（圖4D），靜態(tài)、搖瓶和C.BIRD培養(yǎng)組第18天的細(xì)胞存活率分別為91.7%、86.4%和89.3%（圖4E）。第14天和第18天的個體克隆細(xì)胞數(shù)如圖4F所示。
384孔板接種單細(xì)胞并培養(yǎng)10天后，通過顯微鏡選擇40%匯合度的孔進(jìn)行分析（圖5A）。這些細(xì)胞隨后被轉(zhuǎn)移到96孔板中，其中靜態(tài)培養(yǎng)組繼續(xù)靜態(tài)培養(yǎng)，而C.BIRD培養(yǎng)組則在C.BIRD微反應(yīng)器中培養(yǎng)4天。結(jié)果顯示，C.BIRD培養(yǎng)的平均活細(xì)胞數(shù)為2.30×105個細(xì)胞/孔，高于靜態(tài)培養(yǎng)的1.83×105個細(xì)胞/mL（圖5B）。在第14天，靜態(tài)和C.BIRD培養(yǎng)組的細(xì)胞存活率分別為90.1%和95.0%（圖5C）。繼續(xù)培養(yǎng)至第18天，C.BIRD培養(yǎng)組的平均活細(xì)胞數(shù)達(dá)到2.01×106個細(xì)胞/孔，是靜態(tài)培養(yǎng)組1.09×106個細(xì)胞/孔的約1.8倍（圖5D）。兩組的細(xì)胞存活率在第18天均為93.8%（圖5E）。圖5F展示了第14天和第18天單個克隆的細(xì)胞數(shù)量。
圖4. (A)從96孔平板培養(yǎng)開始，克隆擴(kuò)增流程中選定孔的細(xì)胞融合度（5%）示意圖。（B-E）克隆擴(kuò)增流程的活細(xì)胞數(shù)和細(xì)胞活力從96孔板開始。(F)第14天和第18天的單克隆細(xì)胞數(shù)。
圖5. 從384孔平板培養(yǎng)開始，克隆擴(kuò)增流程中選定孔的細(xì)胞融合度（40%）示意圖。（B-E）從384孔板開始克隆擴(kuò)增流程的活細(xì)胞數(shù)和細(xì)胞活力。(F)第14天和第18天的單克隆細(xì)胞數(shù)。
C.BIRD?微反應(yīng)器不僅提高了懸浮CHO細(xì)胞在96孔和24孔板中的生長，還能在相同培養(yǎng)期內(nèi)從相對較低的初始細(xì)胞密度中增加細(xì)胞數(shù)量，且不犧牲細(xì)胞活性。通過在SCC工作流程的早期克隆擴(kuò)增階段應(yīng)用C.BIRD?微反應(yīng)器，為科研人員提供了一種新的SCC工作流程，以縮短獲取足夠細(xì)胞數(shù)量進(jìn)行擴(kuò)增的時間，并最終減少擴(kuò)增至48孔、12孔或6孔板的步驟。
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