在生物制藥和生物技術產業中，工程化哺乳動物細胞和微生物被廣泛用于大規模生物反應器系統中生產蛋白質產品。溶解氧（DO）是細胞或微生物生長、維持和生產過程中的基本基質。在生物過程的規模放大階段，氧傳遞系數（KLa）是尋找生物反應器最佳培養條件的關鍵參考因素。KLa參數控制著氧氣從氣相轉移到液相的速率，并可能受到生物反應器多種因素的影響，如混合速率、氣流速率、氣泡大小、不同的液體或培養基等[1]。
CYTENA的S.NEST微型生物反應器和S.NEST蓋子允許在標準細胞培養板的每個孔中吸排空氣，實現每個孔內不同混合周期的連續往復混合（圖1A）。因此，S.NEST微型生物反應器將懸浮培養和晚期條件引入到早期細胞系開發（CLD）流程中，提供了比96孔和24孔板靜態培養更多的生長空間和氧氣。目前已證明，S.NEST的微孔板混合培養系統可以顯著增加氧氣傳遞到水性介質中，為需氧培養提供比靜態培養更好的培養環境[2]。因此，我們的混合培養提高了貼壁細胞系HEK293和懸浮細胞系CHO-S的細胞生長速度[3,4]。S.NEST微生物反應器的一個顯著特點是，在整個細胞培養過程中，使用附著在每個孔底部的光學的DO和pH傳感器實時監測DO和pH值(圖1B)。在本篇應用中，我們使用S.NEST板內置的DO傳感器演示了不同工作體積和混合速率下S.NEST微生物反應器中的KLa。
圖1.（A）S.NEST 系統連續往復混合的原理，（B）每個S.NEST板孔底部附有光學傳感器，用于監測DO和pH值
本研究中，所有實驗均在S.NEST微型生物反應器中進行，使用1000 μL或1400 μL的DPBS在37℃下進行培養。測試的混合速率包括每個周期50、30、10、5和2秒。我們使用排氧法來確定KLa，該方法包括三個階段：校準階段、耗氧階段和溶氧階段（圖2）。在校準階段，將DPBS加入S.NEST 24孔板中，蓋上S.NEST蓋，在S.NEST中以10秒/循環的連續混合速率混合1小時，以確保DO飽和。然后將DO水平校準為100%。下一階段為耗氧階段，向S.NEST供氣，使DO耗盡，直至DO濃度達到最低。最后一個階段是溶氧階段，用空氣代替氮氣供應。每隔60秒實時監測三個階段的DO水平。用于確定KLa的時間過程如圖2（紅框）所示。
圖2. KLa測定過程中DO的時間過程，紅框表示用于確定KLa的DO的時間過程
1、混合速率是影響S.NEST中KLa的關鍵因素。在本研究中，我們測試了從2到50秒/周期的五個混合速率，結果表明，KLa隨著混合速率的增加而增加（圖3）。在使用1.0 mL的DPBS時，KLa在2秒/周期的混合速率下達到了最大值30.48 h-1。此外，工作體積也是影響S.NEST中KLa的另一個關鍵因素，增加工作體積對KLa有負面影響。在相同的混合速率下，1.0 mL工作體積的KLa比1.4 mL工作體積的KLa高出約15%。
圖3. 不同混合速率下，加入1.0 mL和1.4 mL DPBS的S.NEST的KLa值，誤差條代表標準偏差
2、基于本研究的KLa，我們分析了KLa與混合速率的相關性(圖4)。KLa與混合速率-1成正比。因此，這些曲線可以作為選擇所需混合速率的指導。如圖5所示，Sartorius Ambr®15細胞培養系統(圖5A)和5L生物反應器(圖5B)在不同條件下的KLa值[5,6]。
圖4. S.NEST微生物反應器中KLa與混合速率的關系
圖5. （A）Ambr15細胞培養系統與（B）5L攪拌式生物反應器在指定條件下的KLa值
本技術說明展示了S.NEST微型生物反應器中KLa值是可調節的。通過調整液體積或混合速率可以獲得不同的KLa值，從而確定需氧培養的最佳培養條件。S.NEST培養板中內置的DO傳感器還可以使用戶能夠在所需條件下手動確定KLa值，以進一步進行過程轉移和規模放大。
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