在大腦這一復(fù)雜的器官中，神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞扮演著至關(guān)重要的角色。包括星形膠質(zhì)細(xì)胞、少突膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞在內(nèi)的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，這些細(xì)胞不僅參與調(diào)節(jié)大腦的穩(wěn)態(tài)功能、髓鞘形成及神經(jīng)信號傳遞，還在神經(jīng)損傷的響應(yīng)中發(fā)揮了重要作用[1]。這些細(xì)胞功能的任何失調(diào)，都可能與發(fā)育性和神經(jīng)退行性疾病的發(fā)病機(jī)制有關(guān)[2]。在大腦樣本中，小膠質(zhì)細(xì)胞通常僅占目標(biāo)群體的10%不到，少突膠質(zhì)細(xì)胞則約占目標(biāo)群體的20%以上，而星形膠質(zhì)細(xì)胞可占目標(biāo)群體的17%至61%[3,4]。細(xì)胞分選可以幫助這些神經(jīng)膠質(zhì)研究，并加強(qiáng)從不同細(xì)胞群中純化單個細(xì)胞類型，正如在大腦中發(fā)現(xiàn)的那樣。
WOLF G2®Cell Sorter：精準(zhǔn)捕捉神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞
NanoCellect Biomedical, Inc. 推出的WOLF G2®Cell Sorter，為研究者提供了一種從新鮮和固定的小鼠腦組織中分離這些關(guān)鍵神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的高效方法。該技術(shù)的應(yīng)用，不僅提高了樣本處理的靈活性，還保證了細(xì)胞的高純度和活性。本應(yīng)用中采用鋅固定法用于處理無法即時使用的腦組織，該方法可以有效的保持細(xì)胞結(jié)構(gòu)和RNA的完整性[5,6]。
在將成年小鼠腦（C57BL/6, Crown Biosciences）放置在裝有EBSS的冰盤中切割成小塊，離心后去除上清液。隨后加入含有HBSS、FBS、HEPES、Dispase II和DNase I的酶混合物中，37°C水浴中酶解。每5分鐘攪拌20次避免組織粘附損失，15分鐘后使用不同大小的槍頭進(jìn)行3次慢速抽打混勻。隨后通過70 μm尼龍網(wǎng)過濾，并使用無鈣和鎂的HBSS、1% BSA和2 mM EDTA組成的低溫分選緩沖液洗滌3次，離心5分鐘。
用1 mL含鎂和鈣的10×HBSS稀釋9 mL Percoll Plus制備等滲Percoll，然后用1×不含鈣和鎂的HBSS進(jìn)一步稀釋該等滲溶液，形成30% Percoll溶液。使用RBC緩沖液去除紅細(xì)胞后，采用30% Percoll溶液進(jìn)行重懸，離心后去除髓鞘。多余的分選緩沖液重懸顆粒離心后用低溫分選緩沖液重懸樣品進(jìn)行細(xì)胞染色。
將快速冷凍的成年小鼠腦(Rockland, MS-T004)于1×鋅緩沖液中4°C處理過夜。次日離心并洗滌后于冰上切碎，使用槍頭抽打分散，然后通過70 μm網(wǎng)過濾，洗滌。用分選緩沖液重懸樣品進(jìn)行細(xì)胞染色。
新鮮細(xì)胞樣本使用ASCA-2 PE、O4 APC和CD11b APC進(jìn)行染色；固定細(xì)胞樣本僅使用ASCA-2 PE染色，新鮮細(xì)胞和固定細(xì)胞在4°C黑暗中孵育30分鐘，然后洗滌。洗滌后將樣品稀釋至終濃度為3.0×105個細(xì)胞/mL，在分析前通過40 μm細(xì)胞過濾器過濾兩次，并在分選前使用DAPI進(jìn)行活細(xì)胞染色。
使用WOLF G2®Cell Sorter，通過儀器紅色激光配置（488/637 nm）及紫色激光配置（405/488 nm）分別對不同標(biāo)記的細(xì)胞進(jìn)行分選。此外，用7-AAD染色樣品，在分選2小時后測量新鮮小鼠組織中星形膠質(zhì)細(xì)胞分選后活力，并與預(yù)分選樣品和由25%熱滅活細(xì)胞及75%活細(xì)胞組成的對照樣品進(jìn)行比較。
1、在分選前，新鮮小鼠腦中星形膠質(zhì)細(xì)胞的起始目標(biāo)群為25.8%，小膠質(zhì)細(xì)胞為15.6%，少突膠質(zhì)細(xì)胞為40.7%。新鮮小鼠腦中分離的星形膠質(zhì)細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞分選后純度分別達(dá)到了92.7%、95.7%和93.2%。固定小鼠腦組織中的星形膠質(zhì)細(xì)胞經(jīng)過分選后，純度從58.2%富集到81.5%。
圖1. 新鮮組織中星形膠質(zhì)細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞、少突膠質(zhì)細(xì)胞和固定組織中星形膠質(zhì)細(xì)胞的純度：對小鼠組織進(jìn)行兩種不同的分選，其中從ASCA-2 PE和O4-APC染色的樣品中分選星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞。隨后用ASCA-2 PE和CD11b-APC染色的樣品進(jìn)行第二次分類，對星形膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行分類。細(xì)胞分選后純度大于90%。同時，固定腦組織的星形膠質(zhì)細(xì)胞分選后純度大于80%。
2、分選前，固定的腦組織樣本在分選前可以觀察到大量星形膠質(zhì)細(xì)胞碎片（圖2A）；分選后，碎片顯著減少，留下的是大部分純化的星形膠質(zhì)細(xì)胞（圖2B）。
圖2. 用ASCA-2(紅色)和DAPI(藍(lán)色)染色細(xì)胞分選前后固定組織代表圖：(A)在分選前對固定組織進(jìn)行分析時，可觀察到星形膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物能夠染色碎片，這突出了添加DPAI-maker區(qū)分碎片和實際細(xì)胞的重要性。(B)細(xì)胞后分選顯示碎片被分選耗盡，根據(jù)DAPI和ASCA-2的合并，分選的細(xì)胞以星形膠質(zhì)細(xì)胞為主(紫色)。細(xì)胞在ECHO Revolve 上以4倍放大率成像。
3、與預(yù)分選樣本相比，新鮮腦組織中分離的星形膠質(zhì)細(xì)胞經(jīng)分選后的活率保持不變，超過90%的細(xì)胞仍然存活。預(yù)分選細(xì)胞活率為92.5%，分選后提高到98.9%。活/死對照混合物的細(xì)胞活率為73.6%，這表明溫和的分選過程有利于維持細(xì)胞活率。
圖3. 星形膠質(zhì)細(xì)胞的活率：7-AAD 被用作從新鮮腦組織中分離出的星形膠質(zhì)細(xì)胞的活性染色劑。活性為對照樣本以及分選前后活細(xì)胞的百分比，表明星形膠質(zhì)細(xì)胞在分選后仍具有活性。
WOLF G2®Cell Sorter的應(yīng)用，為神經(jīng)科學(xué)研究提供了一個強(qiáng)大的工具，使得研究者能夠從復(fù)雜的腦組織中高效地分離出目標(biāo)細(xì)胞群體。無論是新鮮還是固定的樣本，該技術(shù)都能夠保證細(xì)胞的高純度和活率從而獲得更廣泛的組織可用性，可為下游實驗如單細(xì)胞測序等提供可靠的細(xì)胞來源。
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