傳統非病毒轉染效率低，而篩選增強劑需測試數千種化合物，依賴微孔板的高通量技術存在試劑消耗大（每實驗需20 μL）、成本高的瓶頸。德國卡爾斯魯厄理工學院團隊開發的液滴微陣列（DMA）平臺，結合I.DOT非接觸式納升級移液系統，首次實現20 nL級微量體系的高通量轉染篩選：單次篩選774種藥物，完成41796次實驗僅消耗0.84 mL細胞懸液和0.02 μmol藥物，試劑用量較384孔板減少2500倍，成功篩選出14種轉染增強劑，轉染效率提升2-5倍，為基因遞送研究和生物制藥生產提供突破性工具
采用7.5×2.5cm玻璃載玻片，表面圖案化為超疏水背景包圍的親水斑點（500 μm或1 mm邊長），形成588或2187個獨立反應單元，每個單元可容納20-100 nL液滴（圖1A）。
圖1. A）具有588個單獨微滴的1 mm（正方形邊長為1 mm）微滴微陣列（DMA）的代表性圖像。DMA載玻片的尺寸為7.5 ± 2.5 cm。B）明視野顯微鏡圖像，顯示孵育24小時后CHO-K1細胞的形態（比例尺：100 μm）。C）用GFP質粒DNA轉染的HEK 293 T細胞在具有Imm斑點尺寸的液滴微陣列上的代表性圖像（比例尺：Imm）。用GFP質粒DNA轉染的D）HEK 293 T細胞、E）CHO-K1細胞和F）Jurkat懸浮細胞的單個微滴的熒光顯微鏡圖像（比例尺：100 μm）。
藥物分配：通過I.DOT將774種FDA批準藥物（1、10、30 μM三個濃度）以20 nL/spot分配至500 μmDMA，真空干燥去除DMSO（避免細胞毒性）[1]（圖 2A）。
圖2. 原代細胞篩選的工作流程。A）將774種FDA批準的藥物作為DMSO溶液印刷在500 μmDMA載玻片上，并在真空干燥器中干燥過夜。然后將與轉染混合物（ScreenFectA轉染試劑，GFP質粒DNA）混合的細胞印刷到每個斑點中，并與藥物孵育24小時，然后固定和熒光顯微鏡分析。藥物的最終濃度分別為1、10和30×10?6m。將初篩的14種命中化合物打印到1mm DMA載玻片上，并以相同的方式重復該過程，除了使用更大的濃度范圍：1、5、10、20、30和40×10?6m。對于無藥物對照實驗，將轉染混合物打印到空點中。B）設計用于轉染增強劑篩選的高通量篩選方法。在500 μmDMA載玻片（每次實驗20 nL）上進行初步篩選，在1mm DMA載玻片（每次實驗100 nL）上進行二次篩選。在常規高通量篩選平臺384孔板中進行進一步驗證和比較。最后，在優化條件下在96孔板中確認命中。C）篩選了774種FDA批準的藥物，共進行了41796次單獨實驗。各個水性隔室的體積為20 nL，其總共產生僅0.84 mL的總細胞懸浮液，并且僅需要200皮摩爾的藥物（總共0.02摩爾），這比必須在384孔板中進行相同實驗的情況小2500倍。
細胞與轉染復合物分配：I.DOT將含GFP質粒和轉染試劑（ScreenFectA）的CHO-K1、Jurkat、HEK293T細胞懸液以20 nL/spot分配至藥物預處理的DMA，濕度控制在70%以防止蒸發（圖 1B-D）。
檢測與量化：24小時后固定細胞，通過熒光顯微鏡計數GFP陽性細胞（轉染效率）、Hoechst染色（總細胞）、PI染色（死細胞）（圖1C）。
CHO-K1 細胞（難轉染）：以GFP陽性細胞數量為指標，初篩結果顯示藥物對轉染效率的影響具有濃度依賴性（圖3A）。在1 μM濃度下，425種藥物表現出轉染增強效應，349種抑制；10 μM時，624種增強（數量最多），150種抑制；30 μM時，236種增強，538種抑制。這可能與藥物對細胞內吞、轉染復合物運輸及定位的影響差異有關。通過“對照組均值+3倍標準差”閾值，初篩獲得19個（1 μM）、78個（10 μM）和18個（30 μM）候選化合物（圖4），其中7種（如金諾芬、卡托普利等）在不同濃度下均表現出穩定增強效果。
圖3. FDA批準的藥物對CHO-K1細胞轉染效率的影響。A）使用來自20898次總轉染實驗（三次生物重復和每次三次重復）的量化的相對轉染效率數據產生的熱圖。藍色和紅色分別表示與不添加藥物的對照相比，效率的降低或增加。使用了三種不同的藥物濃度：1、10和30×10?6m。B）使用主成分分析（PCA）評分圖的初步篩選結果的概述。每個數字代表FDA批準的藥物庫中的一種藥物。
圖4. 在CHO-K1細胞的初步篩選中鑒定為轉染增強劑的命中化合物。A）774種FDA批準的藥物中的19種是從1×10-6 μM濃度的CHO-K1細胞的初步篩選中獲得的。B）在10×10?6m濃度下鑒定出78種命中化合物。C）在30×10-6 μmCHO-K1細胞處初步篩選獲得的18種命中化合物的散點圖。紅色表示化合物（金諾芬、卡托普利、半硫酸反苯環丙胺、吡羅昔康、卡比多巴、苯唑西林鈉鹽一水合物和硝酸奧昔康唑）在不同濃度下顯示可重復的正增強作用，綠色表示化合物（利福平、酒石酸卡巴拉汀、醋酸氫化可的松、異環磷酰胺、吲達帕胺、甲潑尼龍和鹽酸萘唑啉）在一個濃度下顯示強增強作用。數據表示為三次生物學實驗的平均值±SD，每次三次技術重復。
Jurkat 細胞（懸浮細胞，轉染難度高）：初篩中陽性結果顯著少于CHO-K1細胞。1 μM時244種藥物增強，530種抑制；10 μM時325種增強，449種抑制；30 μM時192種增強，582種抑制。僅在10 μM和30 μM時各篩選出2個和1個候選化合物，且因細胞本身轉染效率極低，增強倍數僅為6-8倍（相對值）
可靠性驗證：通過主成分分析（PCA）對初篩結果進行驗證，顯示候選化合物與對照組差異顯著，與初篩算法結果一致（圖3B），排除了假陽性信號。
從初篩中選取14種增強效果顯著或穩定的化合物（如氫可的松acetate、異環磷酰胺等），在1mmDMA平臺上開展濃度梯度（1-40μM）驗證（圖2B），并引入HEK293T細胞（易轉染）作為對照；轉染效率方面，14種化合物均表現出劑量依賴性，轉染效率較對照組提升1.8-5.1倍（圖5）。其中，吡羅昔康和反苯環丙胺半硫酸鹽在高濃度（30-40μM）下仍保持增強效果，而其余12種因細胞毒性在高濃度時效率下降。
圖5.14種命中化合物對GFP質粒DNA轉染CHO-K1細胞的影響。將不同量的14種命中化合物（金諾芬、卡比多巴、卡托普利、醋酸氫化可的松、異環磷酰胺、吲達帕胺、苯唑西林鈉鹽一水合物、甲潑尼龍、鹽酸萘甲唑啉、利福平、硝酸奧昔康唑、吡羅昔康、反苯環丙胺半硫酸鹽和酒石酸卡巴拉汀）印刷到1mmDMA上，在真空中干燥。
細胞活力：14種化合物均隨濃度升高導致細胞活力下降（PI染色檢測），提示轉染增強效果需平衡藥物毒性。
HEK293T細胞驗證：與CHO-K1趨勢一致，轉染效率提升1.2-3.5倍，進一步支持候選化合物的通用性；而Jurkat細胞未觀察到顯著增強，可能與其本身轉染障礙相關。
384孔板驗證：CHO-K1細胞在最佳濃度下的轉染效率與1mm DMA結果趨勢一致（圖6），盡管384孔板中單個反應的細胞數量更多（1135個/孔vs100個/斑點），但平均效率無顯著差異，證明DMA結果可遷移至傳統平臺。
圖6. 在最佳濃度下，在A）1mm DMA和B）CHO-K1細胞的384孔板上的單個斑點中，兩種形式的所有三個分析重復中，來自初步篩選的命中化合物的影響。單獨顯示了每個拍攝的圖像/每個孔（每個斑點）中的轉染效率。不同的形狀表示單個重復（重復1-正方形，重復2-圓形和重復3-三角形）。根據二次篩選，每種藥物的最佳工作濃度用于每種藥物（表S2，支持性信息）。用在10μLScreenFect稀釋緩沖液中的0.017 μLScreenFectA制備轉染復合物，隨后將在稀釋緩沖液中的總共17ngGFP質粒DNA稀釋至10 μL的最終體積（ScreenFectA與質粒DNA的比例為1：1）。然后將濃度為7.13×104個細胞mL-1的80 μL新鮮細胞懸液加入復合物中，然后混合并以20 μL/孔的體積接種到每個孔中。數據表示為三次生物學實驗的平均值±SD，每次三次技術重復。
96孔板優化驗證：選取4種化合物（氫可的松acetate、萘甲唑啉?HCl等），在優化轉染參數（0.4 μL轉染試劑+100 ngDNA/孔）后，轉染效率從對照組的30.3%提升至33.9%-38.8%，進一步確認了其增強效果。
該研究證明DMA平臺在超微量高通量篩選中的巨大潛力：僅用0.84 mL細胞懸液和0.02μmol藥物完成4萬余次實驗，成本降低2500倍。14種陽性化合物（如金諾芬、卡比多巴等）可將轉染效率提升至5倍，為基因治療載體優化與蛋白生產提供新工具。
I.DOT非接觸分配技術在微量液滴精準操控中的應用，解決了傳統打印的蒸發與污染問題，推動DMA成為細胞生物學與藥物篩選的革新性平臺。未來該技術有望拓展至更多高通量場景，加速生物活性分子的發現進程。
