肝細(xì)胞在體內(nèi)執(zhí)行多種代謝和調(diào)節(jié)過(guò)程，為了了解肝臟生理和疾病發(fā)展，科學(xué)家們可以通過(guò)分離和培養(yǎng)原代肝細(xì)胞，形成模擬體內(nèi)肝臟行為的三維類(lèi)器官。然而，分離原代肝細(xì)胞是非常具有挑戰(zhàn)性的工作。

傳統(tǒng)的流式分選儀的分選環(huán)境對(duì)這些脆弱的細(xì)胞來(lái)說(shuō)可能過(guò)于苛刻，并可能導(dǎo)致分選后細(xì)胞存活率大幅下降，也可能因其難以消毒的流路和工作流程而導(dǎo)致細(xì)胞培養(yǎng)污染。然而，WOLF細(xì)胞分選儀通過(guò)可拋棄式無(wú)菌微流控技術(shù)解決了這些問(wèn)題，整個(gè)分選流程在低（<2 psi）壓力下運(yùn)行，以保持分選環(huán)境無(wú)菌和高細(xì)胞存活率。

在本文介紹的實(shí)驗(yàn)中，合作實(shí)驗(yàn)室分離了原代肝細(xì)胞，以評(píng)估倍體對(duì)增殖的影響。用WOLF和傳統(tǒng)的分選儀分選細(xì)胞，以確定哪種儀器分選的細(xì)胞能夠?yàn)槲磥?lái)的倍性研究提供更好的類(lèi)器官形成和生長(zhǎng)。倍性是指細(xì)胞含有的染色體組數(shù)量（N）會(huì)隨著年齡的增長(zhǎng)而增加，可以抑制體內(nèi)細(xì)胞復(fù)制的速度。肝細(xì)胞倍性水平差異很大，因此確定其對(duì)增殖的影響可以改善類(lèi)器官模型的分選方法，并增加對(duì)肝臟生理學(xué)的理解。

根據(jù)倍體對(duì)肝細(xì)胞進(jìn)行分類(lèi)：首先根據(jù)其較低的FSC和BSC，將NPCs（異質(zhì)性非實(shí)質(zhì)細(xì)胞）排除在肝細(xì)胞門(mén)之外（下圖左）。每個(gè)Vybrant DyeCycle綠色峰表示基于DNA含量具有不同倍性的群體，根據(jù)不同的熒光強(qiáng)度對(duì)4N和8N峰進(jìn)行分選，以評(píng)估兩種倍體細(xì)胞生長(zhǎng)和類(lèi)器官形成的差異。

通過(guò)細(xì)胞成像并將8N核大小與4N核大小進(jìn)行比較來(lái)驗(yàn)證WOLF分選的準(zhǔn)確性。首先用DAPI對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染色，并在40倍下成像，以確定核直徑和面積。分選后倍體顯示，8N肝細(xì)胞核的直徑和面積通常比4N肝細(xì)胞核大兩倍。這證實(shí)了WOLF正確地分選和分離了4N和8N細(xì)胞。

通過(guò)BD FACSAria II分選的8N種群在第0代就顯示出真菌污染，無(wú)法與WOLF進(jìn)行生長(zhǎng)比較（下圖）。由于所有其他條件都是完全一致的，因此污染很可能是由BD分選儀引入的。

在傳代0中，在BD FACSAria II上分選的細(xì)胞沒(méi)有形成類(lèi)器官，這可能是由于從惡劣的分選條件中分選的細(xì)胞受到了傷害（下圖）。但在WOLF上分選的細(xì)胞長(zhǎng)成了類(lèi)器官，其形態(tài)與之前實(shí)驗(yàn)中分選前的肝細(xì)胞類(lèi)器官相似。由于WOLF產(chǎn)生了預(yù)期的形態(tài)并且沒(méi)有污染，因此它被用于進(jìn)一步評(píng)估倍性對(duì)增殖的影響。

4N肝細(xì)胞在分選后顯示出預(yù)期的“葡萄狀”結(jié)構(gòu)，并在第一次傳代后繼續(xù)增殖。8N肝細(xì)胞在分選后仍保持單細(xì)胞簇，其融合度遠(yuǎn)低于4N培養(yǎng)物（下圖）。

與BD FACSAria II不同，WOLF分選的細(xì)胞產(chǎn)生了高度融合和無(wú)菌的3D類(lèi)器官。使用WOLF更能夠避免污染，因?yàn)樗褂昧丝蓲仐壥叫酒凸芙M，所以它的所有管路都是新的、無(wú)菌的。BD FACSAria II與大多數(shù)傳統(tǒng)分選儀一樣，使用無(wú)菌清潔但非無(wú)菌的固定管路，因此污染物可能會(huì)被引入。或者污染也可能來(lái)自露天環(huán)境，而WOLF可以裝在裝有HEPA過(guò)濾空氣的生物安全柜中，能夠避免大多環(huán)境污染。最終影響細(xì)胞存活率和類(lèi)器官長(zhǎng)成率可能是多種儀器因素：更高的分選壓力（20-70psi）、通過(guò)分選噴嘴施加的剪切力以及離開(kāi)系統(tǒng)后經(jīng)歷的減壓沖擊等，這些因素是傳統(tǒng)流式分選儀無(wú)法避免的。而WOLF采用的低壓（<2 psi）微流控分選原理能夠給細(xì)胞提供更溫和的分選環(huán)境，提高細(xì)胞分選的完整性和活率，而4N和8N細(xì)胞核測(cè)量也證實(shí)了WOLF流式分析的準(zhǔn)確性。與4N細(xì)胞相比，8N細(xì)胞表現(xiàn)出減少的生長(zhǎng)和3D類(lèi)器官形成，表明高倍性肝細(xì)胞增殖更慢。總而言之，WOLF的無(wú)菌、高活性分選為研究肝細(xì)胞功能提供了一個(gè)新的實(shí)驗(yàn)平臺(tái)，這些分選優(yōu)勢(shì)也有利于其他與肝細(xì)胞一樣敏感的細(xì)胞類(lèi)型的研究。