我們的研究表明，用于細胞系開發(fā)的 C.BIRD? 微生物反應器能夠改善 96 孔培養(yǎng)的哺乳動物細胞生長情況，并且在細胞生長曲線和蛋白質產量方面與搖瓶培養(yǎng)數(shù)據極為相似。
傳統(tǒng)的細胞系開發(fā)（CLD）流程由于早期和后期開發(fā)過程中產生的細胞系特征不一致，需要花費大量時間才能找到最優(yōu)克隆。C.BIRD 系統(tǒng)是一種新的細胞培養(yǎng)創(chuàng)新技術，通過減少兩個階段之間的細胞特征差異，并在 CLD 流程的早期提供最佳懸浮培養(yǎng)條件，解決了這一問題。在本研究中，我們使用 C.BIRD 系統(tǒng)和不使用 C.BIRD 系統(tǒng)培養(yǎng)中國倉鼠卵巢（CHO）細胞系，并比較了生成的細胞特征與在搖瓶培養(yǎng)環(huán)境中培養(yǎng)的細胞特征之間的差異。結果表明，C.BIRD 提高了活細胞/總細胞生長和細胞活力，并且與大規(guī)模搖瓶培養(yǎng)具有出色的可比性。此外，細胞倍增時間和相對蛋白質產量都有顯著提高，且在統(tǒng)計學上沒有差異。
生物制藥行業(yè)正在呼吁加快細胞系開發(fā)（CLD）流程，以便新生物制品能夠更快獲得監(jiān)管部門的批準。然而，傳統(tǒng)的 CLD 流程可能需要數(shù)月甚至長達一年的時間才能確定最佳的細胞克隆。如此漫長的周期的一個原因是在 CLD 的早期階段選擇合適的克隆時遇到了困難。早期細胞數(shù)量較少，采用靜態(tài)培養(yǎng)。后期則會轉變?yōu)閼腋∨囵B(yǎng)，以擴大細胞產品的產量。從靜態(tài)培養(yǎng)到懸浮培養(yǎng)的轉變會產生不同的細胞系特征（生長速率、滴度、代謝特征等）。這阻礙了在早期 CLD 過程中正確細胞克隆的識別。因此，需要大量的克隆進行測試，這增加了 CLD 的成本和所需時間。為了加快開發(fā)進程，整個過程中保持一致的細胞培養(yǎng)條件至關重要，以便在 CLD 過程中早期識別具有正確且可持續(xù)特征的細胞克隆。
高通量技術正越來越多地應用于細胞培養(yǎng)實驗（CLD）流程中。這些技術能在小規(guī)模的培養(yǎng)皿/試管中提供懸浮培養(yǎng)環(huán)境，并增強氧氣供應。在本研究中，我們展示了一種新的系統(tǒng)，即 C.BIRD 微生物反應器系統(tǒng)，它能夠在標準的 96 孔板中實現(xiàn)早期階段的懸浮細胞培養(yǎng)。C.BIRD 系統(tǒng)結構緊湊，易于放入標準培養(yǎng)箱中。它有一個對接站，可容納三套 C.BIRD 系統(tǒng)（圖 1A）。該系統(tǒng)由兩部分組成：頂部的自主控制箱（圖 1B）和帶有 96 個圓柱形管的消耗性 C.BIRD 蓋子（圖 1C）。C.BIRD 蓋子上的管子提供了 96/24 個液流通道，使得在標準細胞培養(yǎng)板中的每個孔都能吸入和排出空氣。這些通道與氣動連接，并由控制系統(tǒng)驅動，從而在 96 孔板中每個孔內實現(xiàn) 150 - 200 μL 工作體積的連續(xù)往復混合（圖 1D）。有了 C.BIRD，就可以在 96 孔板中實現(xiàn)體積小至 150 - 200 μL 的細胞培養(yǎng)規(guī)模的三維懸浮培養(yǎng)環(huán)境。C.BIRD 可以模擬振蕩器的作用。在良好的細胞培養(yǎng)環(huán)境以及從早期階段就加速細胞系分化（CLD）進程的情況下，從而為細胞更好地生長以及克隆特征的可預測性提供了新的可能性。
本對比實驗的設計如圖 2A 所示。我們研究了 mAb CHO-K1 和 CHO-S 細胞系在兩種不同規(guī)模（從 200 μL 96 孔板到 30 mL 攪拌瓶）下的每日細胞生長、倍增時間以及蛋白質產量，并比較了 96 孔板中的兩種不同培養(yǎng)條件——標準靜態(tài)培養(yǎng)和 C.BIRD 懸浮培養(yǎng)。我們的結果表明，采用懸浮培養(yǎng)的 C.BIRD 系統(tǒng)表現(xiàn)出優(yōu)于靜態(tài)培養(yǎng)的優(yōu)越性能，并且與攪拌瓶培養(yǎng)表現(xiàn)出相當?shù)募毎堤卣?。更重要的是，C.BIRD 懸浮培養(yǎng)的生長曲線與攪拌瓶培養(yǎng)的晚期階段曲線非常相似，這是早期細胞克隆選擇和可預測性的一個重要特征。
在培養(yǎng)細胞五天后，C.BIRD 懸浮培養(yǎng)和搖瓶培養(yǎng)分別實現(xiàn)了每毫升 4.4×10^6 個細胞和 4.9×10^6 個細胞的活細胞密度，而靜態(tài)培養(yǎng)在第五天僅達到 1.2×10^6 個細胞/毫升（圖 2B）。
細胞密度的 3.5 倍差異表明，與靜態(tài)培養(yǎng)相比，C.BIRD 懸浮培養(yǎng)為最大化細胞生長提供了更理想的生長條件。
同樣，每個條件下的總細胞密度也呈現(xiàn)出相同的趨勢。96 孔 C.BIRD 培養(yǎng)和搖瓶培養(yǎng)分別實現(xiàn)了每毫升 5.2×10^6 個細胞和 5.7×10^6 個細胞的總細胞密度，而靜態(tài)培養(yǎng)在第五天僅達到 2.0×10^6 個細胞/毫升（圖 2C）。這些數(shù)據提供了強有力的證據，表明在 96 孔規(guī)模下，C.BIRD 培養(yǎng)提供了最理想的細胞生長條件。對三種培養(yǎng)條件的可行性比較表明C.BIRD 培養(yǎng)法的表現(xiàn)優(yōu)于靜態(tài)培養(yǎng)法，其細胞存活率保持較高水平，與搖瓶培養(yǎng)條件相當。C.BIRD 培養(yǎng)法和搖瓶培養(yǎng)法在第 5 天時細胞存活率仍保持較高水平，分別為 84.3% 和 86.3%。然而，靜態(tài)培養(yǎng)法在第 5 天時細胞存活率降至 60.3%（圖 2D）。
且與靜態(tài)培養(yǎng)相比，C.BIRD 培養(yǎng)法顯著縮短了細胞的倍增時間，從 114 小時縮短至 38.5 小時。在搖瓶培養(yǎng)（35.1 小時）和 C.BIRD 培養(yǎng)（38.5 小時）之間，細胞的分裂時間沒有顯著差異。結果表明，96 孔 C.BIRD 具有高性能水平，并且能夠在早期提供搖瓶生長條件（圖 2E）。
最后，每種培養(yǎng)條件下的細胞系蛋白質產量呈現(xiàn)出相同的模式。與靜態(tài)培養(yǎng)相比，C.BIRD 培養(yǎng)下的蛋白質產量的倍數(shù)變化顯著更高（高 0.7 倍），而 C.BIRD 和搖瓶之間的倍數(shù)變化沒有顯著差異（2.86 倍對 3.21 倍），如圖 2F 所示。
在第 5 天，C.BIRD 懸浮培養(yǎng)達到活細胞密度 5.54×10^6 個/mL，搖瓶培養(yǎng)達到 7.07×10^6 個/mL，而靜態(tài)培養(yǎng)僅達到 1.68×10^6 個/mL。（圖 3A）。就總細胞密度而言，96 孔 C.BIRD 培養(yǎng)達到 6.48×10^6 個/mL，搖瓶培養(yǎng)為 1.2×10^6 個/mL，而靜態(tài)培養(yǎng)為 1.68×10^6 個/mL。（圖 3B）
C.BIRD 懸浮培養(yǎng)組和靜態(tài)培養(yǎng)組之間細胞密度約有 3 倍的差異，這進一步證實了 C.BIRD 懸浮培養(yǎng)組提供了比靜態(tài)培養(yǎng)更好的生長條件。
第 5 天的細胞活力比較顯示，C.BIRD 培養(yǎng)組優(yōu)于靜態(tài)培養(yǎng)組，細胞活力保持較高水平。C.BIRD 培養(yǎng)組的細胞活力維持在 86%，與搖瓶培養(yǎng)組的 99% 相當。然而，靜態(tài)培養(yǎng)組的細胞活力在第 72 小時下降到 72%（圖 3C）。
與靜態(tài)培養(yǎng)組相比，C.BIRD 在第 4 天顯著縮短了細胞倍增時間，從 48.6 小時縮短至 28.1 小時，而搖瓶培養(yǎng)組的倍增時間為 26.2 小時。這些結果證實了 96 孔 C.BIRD 的高表現(xiàn)及其在早期階段提供搖瓶培養(yǎng)條件的能力（圖 3D）。
最后，每種培養(yǎng)條件下的細胞系蛋白質產量都呈現(xiàn)出相同的模式，驗證了我們的陳述。在第 5 天，C.BIRD 懸浮培養(yǎng)組的 CHO-S 細胞產生了 23.52 μg/mL 的蛋白質。在搖瓶培養(yǎng)中，細胞產生的單克隆抗體（mAb）濃度為 24.68 μg/mL，而使用小鼠腹腔細胞培養(yǎng)時，細胞培養(yǎng)液中單克隆抗體的濃度為 100 μg/mL。C.BIRD 的蛋白質產量也顯著高于靜態(tài)培養(yǎng)（15.08 μg/mL），高出 1.5 倍（圖 3E）。
本研究表明，用于細胞系開發(fā)的 C.BIRD 微生物反應器在以下三個方面顯著改善了 96 孔培養(yǎng)環(huán)境中的哺乳動物細胞生長：1）細胞生長；2）倍增時間；3）蛋白質產量
我們還證明了 C.BIRD 系統(tǒng)在細胞生長曲線和蛋白質產量方面與搖瓶培養(yǎng)方式高度相似。總之，C.BIRD 系統(tǒng)能夠使細胞更早地過渡到懸浮細胞培養(yǎng)方式，并且在標準的 96 孔板中具有更高的細胞生長速率，這有可能為后續(xù)的連續(xù)流分離（CLD）過程提供更好的向大規(guī)模搖瓶/生物反應器條件的轉化。
