在生物制藥領域，細胞株開發（CLD）是生物制品研發的關鍵環節，而單細胞克隆（SCC）作為生成穩定蛋白生產細胞系的重要步驟，卻面臨著勞動密集和耗時的挑戰。優化 SCC 流程，對于加速新生物制品的上市進程、降低成本具有深遠意義。過去幾十年，治療性生物制品市場迅速增長，預計2025年全球市場收入將達約3000億美元，其中單克隆抗體（mAb）占比頗高[1]。哺乳動物細胞，尤其是CHO細胞系，因易于培養、產量高、翻譯后修飾有效、人源兼容且獲FDA批準等優勢，成為生物制品生產的主流細胞系。
CLD是生物制品開發的關鍵步驟，旨在從SCC中找到高產細胞系，但該流程勞動密集且耗時長久。在SCC流程中，生物制藥公司必須遵循FDA和歐洲藥品管理局規定以證明生產細胞系的克隆性[2,3]，常用方法包括有限稀釋、熒光激活細胞分選（FACS）和單細胞分配等。本研究中，我們采用CYTENA的 F.SIGHT? 2.0 單細胞分配器和C.BIRD?微生物反應器，聚焦CLD 中的SCC流程優化，尤其是在細胞克隆早期階段，以加速 CLD進程，降低成本，提高效率。單細胞分配器不僅保證了細胞分配器的單克隆性，而且具有較高的細胞存活率和克隆效率[4]。
我們的夏令營覆蓋了廣泛的科技領域，包括計算機編程、機器人技術、3D打印、無人機應用等。我們的課程由一支擁有豐富經驗與知識的導師團隊授課，他們將為孩子們提供個性化的指導和輔導，使孩子們能夠更好地理解和掌握科技知識。
本研究選用表達mAb的CHO-S細胞系，在添加特定成分的 CD Hybridoma Medium 中培養。
分別使用標準 96 孔板和 24 孔板進行 C.BIRD?培養和靜態培養，搖瓶培養則在特定轉速的軌道搖床中進行，所有培養均在 37°C、5% CO?水套培養箱中連續培養3天。
96孔板對比測試中，設置不同初始細胞密度（1×104, 1.5×104, 2×104和3×104細胞/孔），C.BIRD?混合模式為連續模式，混合速率 50秒/循環。24 孔板對比測試中，同樣設置不同初始細胞密度（5×104, 1×105, 2×105和5×105細胞/孔），C.BIRD?混合模式為連續模式，混合速率25秒/循環。培養4天后計數細胞數量和活力。
運用 F.SIGHT? 2.0 將單細胞分配至96孔和384孔板，使用EX-CELL CHO Cloning Medium，96孔板的每孔體積為200 μL， 384孔板的每孔體積為80 μL。F.SIGHT? 2.0 通過高分辨率成像實現單細胞的全自動分離和熒光分選。將CHO-S細胞稀釋至5×105個/mL，將50 μL細胞懸液裝入培養皿。分配器芯片快速生成小液滴，在運行過程中對噴嘴區域進行連續成像，確認液滴為單個細胞，參數正確。然后將這些經過驗證的細胞分配到選定的孔中（圖1）。
比較靜態、搖板和C.BIRD?微反應器培養方法對細胞生長率的影響（圖2）。所有細胞在37℃和5% CO2條件下培養。96孔組細胞經單細胞分配后，靜態培養14天，再轉移到24孔板繼續培養4天；搖板組在96孔板靜態培養后，轉移到搖板培養；C.BIRD組則在96孔板靜態培養10天后，用C.BIRD微反應器培養4天，再轉移到24孔板繼續C.BIRD培養。384孔組在單細胞分配后靜態培養10天，然后轉移到96孔板繼續培養，其中C.BIRD組使用C.BIRD微反應器。在單細胞分配后的第14天和第18天，使用細胞計數器測量細胞密度和活力。
圖2. 克隆擴增實驗設計示意圖。(A)單細胞克隆流程從96孔平板培養開始。(B)單細胞克隆流程從384孔平板培養開始。
96孔板培養結果顯示，接種密度為不同數值時，C.BIRD?培養在第天的活細胞數量顯著高于靜態培養，隨著接種細胞數增加，C.BIRD?培養的活細胞數的優勢明顯，且各組細胞活力均維持在85%以上（圖3A）。
24孔板培養結果顯示，不同接種密度下，C.BIRD?培養在第4天的活細胞數量同樣高于靜態培養，C.BIRD?培養各接種密度的細胞活力多維持在90%以上，而靜態培養在高接種密度時細胞活力有所下降（圖3B）。結果表明，C.BIRD?微生物反應器在低接種密度下顯著提升細胞生長，在96孔板中細胞生長提升約 2.1-2.7倍，24孔板中提升約1.3-1.8倍，且不影響細胞活力。
圖3. 靜態培養和C.BIRD培養的活細胞數和細胞活力。(A) 96孔平板培養，C.BIRD混合條件為連續50秒/循環。(B)對于24孔平板培養，C.BIRD混合條件為連續25秒/循環。
96 孔板接種單細胞并培養10天后，C.BIRD?培養組在部分細胞達到 5% 匯合度時應用反應器（圖4A），結果顯示，C.BIRD組在96孔板中靜態培養10天后，以50秒/周期的連續混合模式使用C.BIRD微反應器培養4天。第14天，C.BIRD組的平均活細胞數是靜態培養的兩倍，達到1.94×105個細胞/孔（圖4B），細胞活力分別為91.4%、88.8%和94.1%（圖4C）。繼續培養至第18天，C.BIRD組的細胞數達到1.56×106個細胞/孔，比其他組高出1.6倍（圖4D），靜態、搖瓶和C.BIRD培養組第18天的細胞存活率分別為91.7%、86.4%和89.3%（圖4E）。第14天和第18天的個體克隆細胞數如圖4F所示。
384孔板接種單細胞并培養10天后，通過顯微鏡選擇40%匯合度的孔進行分析（圖5A）。這些細胞隨后被轉移到96孔板中，其中靜態培養組繼續靜態培養，而C.BIRD培養組則在C.BIRD微反應器中培養4天。結果顯示，C.BIRD培養的平均活細胞數為2.30×105個細胞/孔，高于靜態培養的1.83×105個細胞/mL（圖5B）。在第14天，靜態和C.BIRD培養組的細胞存活率分別為90.1%和95.0%（圖5C）。繼續培養至第18天，C.BIRD培養組的平均活細胞數達到2.01×106個細胞/孔，是靜態培養組1.09×106個細胞/孔的約1.8倍（圖5D）。兩組的細胞存活率在第18天均為93.8%（圖5E）。圖5F展示了第14天和第18天單個克隆的細胞數量。
圖4. (A)從96孔平板培養開始，克隆擴增流程中選定孔的細胞融合度（5%）示意圖。（B-E）克隆擴增流程的活細胞數和細胞活力從96孔板開始。(F)第14天和第18天的單克隆細胞數。
圖5. 從384孔平板培養開始，克隆擴增流程中選定孔的細胞融合度（40%）示意圖。（B-E）從384孔板開始克隆擴增流程的活細胞數和細胞活力。(F)第14天和第18天的單克隆細胞數。
C.BIRD?微反應器不僅提高了懸浮CHO細胞在96孔和24孔板中的生長，還能在相同培養期內從相對較低的初始細胞密度中增加細胞數量，且不犧牲細胞活性。通過在SCC工作流程的早期克隆擴增階段應用C.BIRD?微反應器，為科研人員提供了一種新的SCC工作流程，以縮短獲取足夠細胞數量進行擴增的時間，并最終減少擴增至48孔、12孔或6孔板的步驟。
同騰睿杰（上海）生物科技有限公司作為 Cytena C.BIRD?中國代理商，為您提供優質的售前售后服務。
聯系電話：021-50826962
聯系郵箱：sales@ttbiotech.com
