質量光度法(MP)可對溶液中生物大分子的質量分布進行量化。它在分析蛋白質的純度、表征蛋白質的低聚物狀態以及量化蛋白質與蛋白質之間的相互作用等方面的有效性已經得到證實。在這里,我們的將展示如何利用質量光度法測量DNA的質量、大小和豐度,測量范圍為100到5000個堿基對。
在本文中,將概述如何應用MP測量核酸,并展示了從較短DNA鏈到整個質粒的DNA的樣本測量示例。
DNA和RNA在溶液中都帶負電荷,它們會被未經處理的蓋玻片排斥。因此,核酸檢測顯示出不頻繁的瞬時結合,這導致MP數據中的事件數量少且定義不清,觀察到的解除結合與結合一樣多(下圖藍色部分)。使用poly-lysine(PLL)簡單處理玻片即可避免這種情況的發生,使得檢測結果真實可信(下圖灰色部分)。
不同分子類型的光學特性(特別是折射率)會有所不同。因此,為了正確地將所測得的對比度與分子質量相關聯,應使用已知質量的、與被分析物分子類別相同的混合分子樣本進行校準。這些針對不同分子類別的校準結果均顯示出對比度與質量之間的普遍線性相關關系,但斜率不同(下圖)。與蛋白質的測量類似,市售的標準品(如凝膠電泳用)可用于校準DNA 測量。
為了證明MP測量對核酸的實用性,我們使用了極少量的樣品(3 ng)來測定PCR產物的質量和均勻性。測量結果顯示,在218 kDa處有一個有效峰,相當于331 bp(下圖),與預期長度 335 bp 非常接近。
為了測試能否以類似的精度分析更長的DNA鏈,我們對質粒pUC18進行了測量(下圖)。檢測到了約5000 bp的DNA片段和低于1000 bp的較短DNA片段。
綜上所述,這次實驗證明了質量光度法檢測核酸的能力,質量光度法是一種新興的、快速且先進有效的核酸定量分析技術,可替代現有技術,在幾分鐘內對極少量樣品進行質量測定和純度評估,且無需使用任何染色劑。
Refeyn Two MP與 Refeyn SamuxMP是基于質量光度法(MP)技術的臺式單分子質量分析系統,其機身緊湊,安裝簡便。僅需消耗幾微升樣品和潔凈的玻片,就能直接測量溶液中單個分子的質量,并且無需任何標記,為生物分子檢測創造了無限可能。
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