在生物生產(chǎn)領(lǐng)域，單克隆性是至關(guān)重要的，它要求細(xì)胞來自單個細(xì)胞且具有遺傳同質(zhì)性。傳統(tǒng)的單細(xì)胞克隆方法，如有限稀釋法，是基于泊松統(tǒng)計概率來估計單克隆性的；這種方法存在諸多弊端，它不僅耗時、通量低，而且需要細(xì)胞擴(kuò)增來確定理想的候選細(xì)胞。此外，由于有限稀釋可能導(dǎo)致每個孔中有多個細(xì)胞，所以往往需要多輪克隆來提高單克隆性的概率[1-3]。
NanoCellect Biomedical, Inc.推出的WOLF G2流式細(xì)胞分選儀，它們能夠篩選數(shù)百萬個細(xì)胞，并根據(jù)多達(dá)11個參數(shù)對感興趣的細(xì)胞進(jìn)行特異性分選和單細(xì)胞分配，從而滿足細(xì)胞系開發(fā)的需求。本文使用了一種常見的熒光參數(shù)—活力染料，來提高細(xì)胞的生長。DRAQ7就是一種用于檢測細(xì)胞活力的遠(yuǎn)紅色生物標(biāo)志物，它可以與細(xì)胞膜受損細(xì)胞中的雙鏈DNA（dsDNA）結(jié)合 [4,5]。利用配置有488nm和637nm雙激光的WOLF G2來分選帶有DRAQ7的GFP + HEK293細(xì)胞，可以完全排除死細(xì)胞，在進(jìn)行單細(xì)胞克隆時最大化鋪板密度和細(xì)胞的生長[6]。
鞘液和樣品緩沖液由1xPBS、0.5% BSA、5mM EDTA和12.5mM HEPES組成。實驗設(shè)置了多個對照組，包括未染色的HEK293T陰性對照、用DRAQ7染色的活：死（50:50）HEK293T對照以及GFP + HEK293對照。用于分選的樣品中含有75%的HEK293T和25%的GFP + HEK293T細(xì)胞，并用DRAQ7染色，最終濃度為1.0x10?cells/mL。
在分析過程中，應(yīng)用補(bǔ)償來創(chuàng)建一個矩陣（圖1）。將帶有細(xì)胞門的散點圖應(yīng)用于FSC-H與FSC-width圖以創(chuàng)建單線門。單線門應(yīng)用于雙變量圖（DRAQ7 vs FITC）。
圖1. 基于DRAQ7和GFP標(biāo)記的細(xì)胞分選結(jié)果分布圖
將細(xì)胞分選到預(yù)先填充有200 uL完整克隆培養(yǎng)基的三個96孔板中，同時準(zhǔn)備一個采用有限稀釋法（1.0細(xì)胞/孔）的96孔板作為對照。這些板在37°C、5% CO?的環(huán)境中培養(yǎng)，并在第0天使用酶標(biāo)儀的綠色熒光通道檢測可能生長成菌落的GFP+細(xì)胞。在第7天和第14天，使用明場和綠色熒光通道確認(rèn)菌落形成并確定細(xì)胞生長情況。而且，這個實驗重復(fù)了三次，每次都使用不同的無菌WOLF分選盒和流體系統(tǒng)。
1、在總體生長情況上，使用配置637nm激光的WOLF G2對帶有DRAQ7的GFP+ HEK293細(xì)胞進(jìn)行單細(xì)胞分選以排除死細(xì)胞時，觀察到平均總生長率為81±3.9%，相比有限稀釋法的20±8.1%，提高了約4倍（圖2）。
圖2. 14天后HEK293 GFP的平均總生長量：與有限稀釋法相比，使用WOLF G2用于單細(xì)胞集落時，觀察到生長量增加了4倍。
2、在單克隆生長情況方面，在第0天、第7天和第14天對96孔培養(yǎng)板進(jìn)行分析時，確認(rèn)WOLF G2導(dǎo)致了74±2.9%的單克隆生長，與有限稀釋法制備的板中20±7.6%相比，提高了3.75倍（圖3）。
圖3. 與有限稀釋法相比，使用WOLF G2進(jìn)行單細(xì)胞克隆時的平均單細(xì)胞沉積：與極限稀釋相比，用于單細(xì)胞克隆的WOLF G2產(chǎn)生了3.75倍的孔，其中含有源自單個細(xì)胞的單個菌落。
3、單克隆性通過在第0天、第7天和第14天使用Celigo分析細(xì)胞，追溯確認(rèn)檢測到的顆粒實際上是細(xì)胞，并通過觀察它們生長成菌落來驗證單克隆性。同時，多天的測量也確保了含有菌落的孔確實來自單個細(xì)胞（圖4）。
圖4. 在第0天、第7天和第14天顯示單細(xì)胞生長的代表性孔：在使用WOLF G2和N1進(jìn)行單細(xì)胞分選時，第0、7和14天用于確定菌落是否來自沉積在孔中的單個細(xì)胞。注意細(xì)胞如何保持在相同的位置，并隨著細(xì)胞的生長而增大。
4、總生長結(jié)果與我們之前使用WOLF在沒有活性染料的情況下對GFP+ HEK293細(xì)胞進(jìn)行分選的結(jié)果一致。先前研究的平均總生長為78±5.5%（圖5）[7]。
圖5. 與WOLF、WOLF G2和有限稀釋法相比，HEK293 GFP的平均總產(chǎn)出量在范圍內(nèi)，無論使用哪種WOLF。由于能夠產(chǎn)生更多的單細(xì)胞克隆，使用WOLF的單細(xì)胞分選優(yōu)于限制稀釋。
這項研究表明，WOLF G2與傳統(tǒng)的有限稀釋法等方法相比，能夠確保更高的單克隆性。而且，WOLF G2還有多種激光配置可供選擇，如488-405nm和488-561nm等，可用于各種遺傳標(biāo)記、常規(guī)染料和新興化學(xué)物質(zhì)，以滿足細(xì)胞系的開發(fā)以及其他克隆或樣品制備工作流程的需求。
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