微生物單細(xì)胞基因組學(xué)（SCG）為了解稀有和難培養(yǎng)微生物的基因組提供了手段，是與宏基因組學(xué)互補(bǔ)的方法。由于單個(gè)微生物細(xì)胞中DNA的水平低，因此在進(jìn)行基因組測(cè)序之前需要進(jìn)行全基因組擴(kuò)增（WGA）。然而，最常見(jiàn)的WGA方法——多重位點(diǎn)擴(kuò)增（MDA），十分昂貴且對(duì)特定基因組區(qū)域有偏差，阻礙了高通量應(yīng)用，導(dǎo)致基因組覆蓋不均勻。因此，從許多物種（尤其是微生物群落中的少數(shù)成員）中獲得高質(zhì)量的基因組變得困難。在這里，我們提出了一種體積縮減方法，在標(biāo)準(zhǔn)384孔板中顯著降低成本的同時(shí)提高了DNA擴(kuò)增產(chǎn)物的基因組覆蓋度和均勻性。我們的結(jié)果表明，為獲得更高質(zhì)量的微生物基因組，在專業(yè)化和復(fù)雜的設(shè)置（例如微流體芯片）中進(jìn)行進(jìn)一步的體積縮減可能不必要。這種體積縮小方法使得SCG在未來(lái)的研究中更加可行，從而有助于我們更廣泛地了解環(huán)境中那些未被深入研究和未被充分描述的微生物的多樣性和功能。
圖1 單細(xì)胞基因組學(xué)的工作流程。
A：獲得環(huán)境樣本后應(yīng)該立即加工，或在冷凍保護(hù)劑的存在下深度冷凍保證細(xì)胞的完整性。
B：細(xì)胞通常用非特異性熒光染料染色，如 DAPI或SYBR®Green，但它們也可以被特異性標(biāo)記，例如，熒光原位標(biāo)記雜化。
C：熒光活化細(xì)胞分選（FACS）是最常見(jiàn)的物理分選方法，可將單個(gè)細(xì)胞分離到多孔板中。
D：一旦單個(gè)細(xì)胞被分離出來(lái)，就會(huì)用堿性緩沖液和反復(fù)凍融的方法將其破碎，以釋放出細(xì)胞中的DNA。
E：由于典型的原核細(xì)胞DNA含量低，因此需要進(jìn)行全基因組擴(kuò)增（WGA）來(lái)產(chǎn)生足夠的DNA用于文庫(kù)準(zhǔn)備。
F：一旦準(zhǔn)備好了DNA文庫(kù)，就可以分別使用Illumina®和Oxford Nanopore Technologies®等短讀/長(zhǎng)讀測(cè)序平臺(tái)。
G：利用生物信息學(xué)進(jìn)行序列質(zhì)量評(píng)估、組裝、分類、ORF呼叫和注釋。
一些微生物體內(nèi)只含有幾飛克DNA，所以其中WGA這一步操作至關(guān)重要，為接下來(lái)文庫(kù)的制備和測(cè)序奠定基礎(chǔ)。近幾年來(lái)不同的WGA方式也在不斷發(fā)展，但基于PCR的擴(kuò)增方法不適用于DNA含量極低的微生物，因此使用phi29高保真酶的MDA方法應(yīng)運(yùn)而生，但MDA整體反應(yīng)的耗費(fèi)極高，因此使用受限。在這里，我們列舉了幾種不同的WGA方法。見(jiàn)下表。
表1 微生物單細(xì)胞基因組擴(kuò)增方法的特點(diǎn)
MDA：多重置換擴(kuò)增；WGA-X：全基因組擴(kuò)增-X；PTA：原始模板導(dǎo)向擴(kuò)增；MALBAC：多重退火和循環(huán)擴(kuò)增。
常規(guī)的WGA方法反應(yīng)體系較大，每個(gè)反應(yīng)的花費(fèi)也較高。因此我們嘗試縮小體系。
圖2 單倍體基因組（SAG）組裝統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)。
（A）最終序列深度，即估計(jì)的每個(gè)基因組堿基平均測(cè)序次數(shù)。
（B）組裝的總平均長(zhǎng)度。
（C）N50平均值，即支持基因組組裝50%的最小片段長(zhǎng)度。
（D）組裝覆蓋整個(gè)E.oil的百分比。
（E）通過(guò)MDMCleaner確定組裝基因組的完整性，
（F）組裝中的污染堿基百分比，方框中間的線表示中位數(shù)，x表示平均值。五重復(fù)數(shù)據(jù)計(jì)算。
總體而言，這些結(jié)果表明，在1.25 uL的反應(yīng)體積下進(jìn)行的MDA操作極大地改進(jìn)了該方法，產(chǎn)生的SAGs相比于標(biāo)準(zhǔn)的大反應(yīng)體積，具有更少的偏差、更少的污染和更完整的特性。
采用標(biāo)準(zhǔn)384孔板搭配商用細(xì)胞分選機(jī)和液體分配器，對(duì)其他研究人員來(lái)說(shuō)也很方便。標(biāo)準(zhǔn)50 LMDA反應(yīng)（表1）這種方法降低了97.5%的成本。研究者初步工作發(fā)現(xiàn)WGA-X工作1.25 uL反應(yīng)量也是如此。本文所做的改進(jìn)將對(duì)其他單細(xì)胞研究產(chǎn)生極大的影響，從而增加SCG的使用，特別是用于闡明環(huán)境樣本中稀有類群和/或新型微生物暗物質(zhì)的基因組潛力的研究。
在整個(gè)工作流程中，分離出單細(xì)胞并進(jìn)行裂解這一步采用了I.DOT非接觸式納升級(jí)移液系統(tǒng)。
Dispendix I.DOT非接觸式分液系統(tǒng)作為一款納升級(jí)（nl）的微量液體分配設(shè)備，采用即時(shí)噴點(diǎn)移液技術(shù)，系統(tǒng)共有8個(gè)獨(dú)立控制的正壓通道。進(jìn)行液體分配時(shí)，在底部具有微米級(jí)小孔的源板（Source Plate）上方施加一個(gè)特定的壓力脈沖，使小孔底部生成一個(gè)最小2.55 nl，最大50 nl的液滴，可以釋放到目標(biāo)板（Target Plate）的任意孔中，每個(gè)通道每秒最多可生成100個(gè)液滴，通過(guò)液滴數(shù)量的調(diào)節(jié)，實(shí)現(xiàn)從納升到微升級(jí)別的液體分配。
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