本研究采用CHO-K1和CHO-S單克隆抗體表達細胞系作為模型，比較了傳統靜態培養、搖瓶培養和C.BIRD?培養方法對細胞生長的影響。細胞在無血清、化學成分定義的CD Hybridoma培養基中培養，使用標準的24孔板進行C.BIRD和靜態培養，每個孔的總體積為1400 μL。搖瓶培養則在130 rpm的軌道搖床中進行，總體積為30 mL。所有細胞和C.BIRD設備在37°C、5% CO2水套培養箱中連續培養3天。使用細胞計數器（Bio-Rad, TC20）計數細胞數量和活率。每天的細胞數在同一板的不同孔中獨立測量，以避免細胞培養過程中額外的擾動。細胞計數后，每孔補充與細胞計數相同量的培養基，在隨后的幾天內不再測量。蛋白產量通過ELISA試劑盒（Bethyl Lab, E88-104）測量。統計學采用單因素方差分析。

實驗設計由圖1所示，在靜態培養、C.BIRD培養和搖瓶培養中測定CHO-K1及CHO-S單克隆抗體(mAb)細胞株的總細胞密度、活細胞密度、倍增時間及蛋白產量。CHO-K1的初始接種密度為0.33×10⁶個細胞/mL，CHO-S的初始接種密度為0.5×10⁶個/mL，每天三次測量各組總細胞密度和活細胞密度，為期3天。

圖1. 實驗設計示意圖。比較三種不同的細胞培養方法。這些組的測量提供了不同培養環境下的單個細胞概況

1、 實驗結果顯示，與傳統靜態培養相比，C.BIRD?培養的CHO-K1細胞在第3天的活細胞密度和總細胞密度顯著提高。C.BIRD組的平均活細胞密度和總細胞密度分別達到2.87×10^6 cells/mL和3.06×10^6 cells/mL，均顯著高于靜態培養組(圖2A和2B)。表明C.BIRD?培養方法在24孔板中改善了細胞培養環境，提供了更高的承載能力。

2、C.BIRD組顯著縮短了CHO-K1細胞的平均倍增時間，從35小時縮短到24小時，與搖瓶培養組的23小時相比，沒有顯著差異（圖2C）。這表明C.BIRD?方法提高了CHO-K1細胞的增殖率，并在實驗的早期階段提供了與搖瓶培養相似的細胞增殖特性。而在蛋白產量方面，C.BIRD組的蛋白產量與搖瓶培養組相當，幾乎是靜態組的4倍（圖2D）。這表明C.BIRD?方法在24孔標準板上能夠篩選出具有高一致性的細胞特征，這些特征在CLD過程的后期階段得以保持。

圖2. A和B：3組的日活細胞/總細胞密度:24孔板靜態培養、搖瓶培養和24孔板C.BIRD培養。C：3組在第3天的倍增時間。D：3組在第3天蛋白質產量。統計學采用單因素方差分析，P值的顯著性分別為:>0.05 ns、<0.05(*)、<0.01(**)、<0.001(***)、<0.0001(****)。數據以mean±SD表示。

3、與傳統靜態培養相比，C.BIRD?培養的CHO-S細胞在第3天的活細胞密度和總細胞密度顯著提高。C.BIRD組的平均活細胞密度和總細胞密度分別達到2.67×10^6 cells/mL和3.03×10^6 cells/mL，均顯著高于靜態培養組(圖3A和3B)。此外，與靜態組相比，C.BIRD組顯著縮短了CHO-S細胞在第3天的平均倍增時間，從42.43小時縮短至29.77小時(圖3C)。這些結果表明，C.BIRD方法比靜態方法更能有效地提高CHO-S細胞在實驗早期的細胞增殖率。

4、在蛋白產量方面，C.BIRD懸浮培養細胞產生17.01μg/mL mAb，而靜態培養和搖瓶培養細胞產生10.22和21.11μg/mL mAb。與靜態培養法相比，24孔標準板上的C.BIRD方法可以提高蛋白質產量。C.BIRD和搖瓶培養方法之間較高的蛋白產量一致性有效地支持了在CLD過程后期篩選細胞譜具有高一致性的理想克隆。

圖3. A和B：3組的日活細胞/總細胞密度:24孔板靜態培養、搖瓶培養和24孔板C.BIRD培養。C：3組在第3天的倍增時間。D：3組在第3天蛋白質產量。統計學采用單因素方差分析，P值的顯著性分別為:>0.05 ns、<0.05(*)、<0.01(**)、<0.001(***)、<0.0001(****)。數據以mean±SD表示。