雙特異性抗體 (bsAbs) 是一類工程binder，旨在同時(shí)靶向兩個(gè)化學(xué)上不同的表位。這種獨(dú)特的結(jié)合模式可用于誘導(dǎo)以前無(wú)法實(shí)現(xiàn)的作用機(jī)制，在腫瘤學(xué)、自身免疫性疾病、慢性炎癥性疾病、出血性疾病甚至傳染病的許多治療應(yīng)用方面具有巨大潛力。bsAbs 的結(jié)合特性對(duì)其功能至關(guān)重要，因?yàn)樾纬上嗷プ饔玫膬A向、相互作用的穩(wěn)定性（半衰期）和平衡親和力都會(huì)影響作用機(jī)制。對(duì)于兩個(gè)分子之間的二元相互作用，結(jié)合可以用三個(gè)生物物理參數(shù)直接描述，即結(jié)合速率常數(shù) kon、解離速率常數(shù)Koff以及平衡解離常數(shù) Kd。對(duì)于雙特異性binder，情況更為復(fù)雜，因?yàn)楸仨毧紤]兩種不同的二元相互作用，從而產(chǎn)生三元相互作用（圖 1）。此外，三元復(fù)合物可能會(huì)因其他協(xié)同因素而穩(wěn)定或不穩(wěn)定，例如三種結(jié)合劑的空間排列、構(gòu)象靈活性或參與相互作用的分子部分的局部濃度。
圖1. 雙特異性抗體與細(xì)胞表面兩個(gè)靶標(biāo)相互作用的二元和三元結(jié)合模式。
三元復(fù)合物的穩(wěn)定性取決于所有可能的（不）結(jié)合情況的結(jié)合和解離動(dòng)力學(xué)。由于多個(gè)參數(shù)相互依賴，單獨(dú)測(cè)量二元結(jié)合動(dòng)力學(xué)不足以預(yù)測(cè)三元復(fù)合物的行為。傳統(tǒng)的分子互作分析方法并不適用于表征涉及 bsAbs 的三元復(fù)合物。例如SPR)測(cè)量得出的結(jié)合值與 ELISA 測(cè)定和生物活性存在顯著偏差。這可能是因?yàn)?SPR 或類似的傳感器無(wú)法區(qū)分 bsAb 是否與傳感器表面的一個(gè)或兩個(gè)目標(biāo)結(jié)合，因?yàn)檎凵渎蕚鞲兄荒軝z測(cè)到傳感器上分析物分子的存在，但無(wú)法識(shí)別相互作用過(guò)程中建立了多少個(gè)鍵。此外，當(dāng)在葡聚糖修飾表面使用常規(guī)共價(jià)固定策略時(shí)，很難以明確的化學(xué)計(jì)量將一種以上的抗原固定在表面上。最關(guān)鍵的限制是此類夾心法檢測(cè)不能反映兩種抗原同時(shí)在同一細(xì)胞表面呈遞給 bsAb 的情況，這會(huì)導(dǎo)致抗體結(jié)合行為產(chǎn)生avidity。以 emicizumab（商品名Hemlibra®） 為例，avidity實(shí)際上是 FX 激活過(guò)程中天然血小板表面所需的結(jié)合模式，是產(chǎn)生生物活性的先決條件（圖2）。
圖2. FIX、FX與FVIIIa形成三元復(fù)合物催化凝血酶形成示意圖。
為了描述雙特異性治療性抗體 emicizumab 的二元和三元結(jié)合特性。我們?cè)O(shè)計(jì)（見(jiàn)圖3）并使用了一種靈活的Y形DNA納米結(jié)構(gòu)將抗原固定在傳感器上，使兩個(gè)靶標(biāo)都可被溶質(zhì)bsAb結(jié)合。使用雙色熒光檢測(cè)，我們可以實(shí)時(shí)跟蹤emicizumab 的各個(gè)互補(bǔ)位與其各自靶標(biāo) FIX 和 FX 的結(jié)合情況（圖4）。
圖3. 芯片及Y結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)原理示意圖。(a) 帶有微流體通道的 heliX® 生物芯片，該通道具有兩個(gè)檢測(cè)spot；(b) 單鏈錨定寡脫氧核苷酸共價(jià)連接到芯片的金表面，以便進(jìn)一步與 DNA 功能化；DNA Y 結(jié)構(gòu)由兩條適配鏈組成，這些適配鏈用綠色和紅色染料修飾以進(jìn)行熒光檢測(cè)（實(shí)心圓），兩條配體鏈與相應(yīng)的靶標(biāo)（FIX = 空心圓，F(xiàn)X = 空心五邊形）結(jié)合；預(yù)成型的 Y 結(jié)構(gòu)通過(guò)將其堿基雜交到芯片表面的“錨”鏈上而固定 (c) 用 DNA Y 結(jié)構(gòu)功能化的芯片表面，具有兩個(gè)柔性臂，用于在不同距離處顯示抗原。；(d) Emicizumab 與 FIX 和 FX 靶標(biāo)結(jié)合。測(cè)量靠近各個(gè)靶標(biāo)的綠色和紅色染料的熒光變化，以分別分析抗體臂與 FIX 和 FX 的結(jié)合。
圖4. 實(shí)時(shí)測(cè)量 Emicizumab 與固定在 DNA Y 型結(jié)構(gòu)上的 FIX 和 FX 的結(jié)合和解離。bsAb emicizumab 的濃度為 0.0512、0.128、0.32、0.8、2、5 μM。(a) 二元 FIX – emicizumab 相互作用在僅用 FIX（無(wú) FX）修飾的 Y 型結(jié)構(gòu)上測(cè)量，信號(hào)檢測(cè)為綠色。(b) 二元 FX – Emicizumab 相互作用在僅用 FX（無(wú) FIX）修飾的 Y 型結(jié)構(gòu)上測(cè)量，信號(hào)檢測(cè)為紅色。(c) 和 (d) 三元相互作用在用 FIX 和 FX 修飾的 Y 型結(jié)構(gòu)上測(cè)量。信號(hào)同時(shí)以綠色 (C) 和紅色 (D) 測(cè)量。(e) 分析的結(jié)合（頂部）和解離（底部）速率常數(shù)的速率尺度圖，以及解離常數(shù) KD（中間）。二元相互作用 (a、b) 和三元 FX 相互作用 (D) 用單指數(shù)擬合函數(shù)分析，F(xiàn)IX 臂上的三元相互作用 (C) 用雙指數(shù)擬合函數(shù)分析。擬合線在測(cè)量數(shù)據(jù)上繪制為平滑線，采樣時(shí)間為 200ms。
對(duì) bsAb emicizumab 的二元和三元結(jié)合動(dòng)力學(xué)的測(cè)量產(chǎn)生了三個(gè)重要發(fā)現(xiàn)。首先，bsAb 與其兩個(gè)靶標(biāo)的兩種二元相互作用明顯不同，emicizumab 與 FX 的結(jié)合速度比 FIX 快 5 倍、穩(wěn)定 20 倍，總體上強(qiáng) 100 倍。其次，三元結(jié)合明顯不同于二元結(jié)合，并表現(xiàn)出雙相解離特性。第三，三元結(jié)合的發(fā)生程度取決于結(jié)合階段 bsAb 的濃度。這些結(jié)果表明了以下解釋，該解釋以圖形方式總結(jié)在圖 5 中。如圖 5(a) 所示，三元復(fù)合物的形成發(fā)生在低 bsAb 濃度下。在第一步中，當(dāng) emicizumab 遇到 Y 結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)的兩個(gè)靶標(biāo)時(shí)，它最好先與 FX 結(jié)合，因?yàn)榻Y(jié)合速率比 FIX 高 5 倍。在第二步中，emicizumab 的另一條臂與 FIX 結(jié)合，后者通過(guò) Y 型結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)在 emicizumab 的觸及范圍內(nèi)。由于 FX 結(jié)合的 emicizumab 已經(jīng)接近 FIX，因此這種交接發(fā)生得很快（與 FX 結(jié)合相比），這就是為什么在 FIX 的綠色信號(hào)中也觀察到了類似 FX 的結(jié)合率。當(dāng)然，emicizumab 與 FIX 或 FX 之間發(fā)生二元相互作用而不形成三元復(fù)合物也是可能的，也可能通過(guò)較弱的相互作用 FIX 捕獲形成三元復(fù)合物，但這些過(guò)程發(fā)生的可能性要小得多。隨后三元復(fù)合物開(kāi)始衰變。一旦兩個(gè)靶標(biāo)都參與其中，三元和二元狀態(tài)之間就會(huì)發(fā)生動(dòng)態(tài)轉(zhuǎn)變。然而，由于 FIX 的結(jié)合力要弱得多，在整個(gè)復(fù)合物最終完全解離之前，很可能是 FIX 而不是 FX 被其 Fab 釋放并反彈了好幾次或很多次。因此，雖然涉及較弱結(jié)合劑 FIX 的相互作用會(huì)因強(qiáng)結(jié)合劑 FX 的存在而增強(qiáng)，但 FX 相互作用卻幾乎不受弱相互作用劑 FIX 存在的影響，因?yàn)樗酰瑹o(wú)法顯著改變 FX 的動(dòng)力學(xué)。因此，在二元和三元情況下觀察到的 FX 動(dòng)力學(xué)相似。
圖 5. 低 (a) 和高 (b) 濃度的 emicizumab 的主要結(jié)合模式示意圖。 (A) 在低濃度下，與 FX 的更快結(jié)合會(huì)捕獲抗體并允許快速移交給 FIX，從而形成三元復(fù)合物。(B) 在高濃度下，親和力較低的 FIX 也會(huì)快速結(jié)合抗體，從而在一個(gè) Y 型結(jié)構(gòu)上產(chǎn)生兩個(gè)二元相互作用。(A) 和 (B) 的組合可觀察為濃度依賴性雙指數(shù)解離曲線。
如圖 5(b) 所示，在高 bsAb 濃度下，三元復(fù)合物的形成受到抑制。在微摩爾濃度的 bsAb 下，溶液中的 bsAb 結(jié)合與 FX 促進(jìn)的捕獲和交接機(jī)制競(jìng)爭(zhēng)。預(yù)計(jì)當(dāng)溶液中的抗 FIX Fabs 濃度超過(guò) Y 結(jié)構(gòu)上的局部濃度時(shí)會(huì)發(fā)生這種情況，該濃度已確定在 0.1–0.2 μM 范圍內(nèi)。因此，當(dāng)溶液中的 bsAb 濃度遠(yuǎn)高于 0.1 μM 時(shí)，二元結(jié)合模式下的雙重捕獲更受青睞。在較高分析物濃度下形成的三元復(fù)合物較少，這一發(fā)現(xiàn)讓人想起高劑量“hook”效應(yīng)，這是免疫測(cè)定中的常見(jiàn)干擾。通常，在結(jié)合過(guò)程中，抗體的一條臂與一個(gè)靶標(biāo)結(jié)合，然后第二條臂與第二個(gè)靶標(biāo)結(jié)合，形成三元復(fù)合物。在高分析物濃度下，兩種抗體同時(shí)與一個(gè)靶標(biāo)對(duì)結(jié)合的可能性更大，從而阻止三元復(fù)合物的形成。了解這些結(jié)合特性使我們能夠了解 emicizumab 在體內(nèi)的作用方式。在血漿中，F(xiàn)IX 和 FX 的濃度分別為 90 和 135 nM。盡管預(yù)計(jì) Emicizumab 會(huì)與溶液中的兩種凝血因子頻繁相互作用，但模擬表明，只有極小部分的 Emicizumab 在血漿中形成三元復(fù)合物。這是因?yàn)椋绻湎嗷プ饔脹](méi)有通過(guò) FX 介導(dǎo)的表面親和力穩(wěn)定，它會(huì)快速與 FIX 解離。只有當(dāng) FIX 和 FX 在損傷后與活化的血小板結(jié)合時(shí)，才能與 Emicizumab 建立三元復(fù)合物。
heliX+分子互作分析系統(tǒng)采用switchSENSE®技術(shù)，通過(guò)共價(jià)偶聯(lián)或標(biāo)簽捕獲方式將感興趣的分 子（配體）固定在heliX®芯片上,結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)的自動(dòng)化 工作流程為分子互作提供高效解決方案。
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