在細(xì)胞培養(yǎng)過程中評(píng)估細(xì)胞生長和活力十分重要，技術(shù)的進(jìn)步使離線細(xì)胞監(jiān)測(cè)成為可能，與在顯微鏡下手動(dòng)計(jì)數(shù)相比，節(jié)省了研究人員更多的時(shí)間。然而，這種方法效率依然低下，不適合高通量或連續(xù)培養(yǎng)。因此，需要實(shí)現(xiàn)實(shí)時(shí)監(jiān)控，包括激光濁度、吸氧速率(OUR)、溶解氧(DO)和pH值等。

溶解氧和pH值的測(cè)量已廣泛應(yīng)用于生物反應(yīng)器的在線監(jiān)測(cè)。它是分析細(xì)胞生長和代謝的必要條件。DO水平隨生物量的增加而降低，這與細(xì)胞呼吸和OUR有關(guān)。隨著細(xì)胞呼吸和葡萄糖代謝產(chǎn)生更多的CO₂和乳酸，pH值會(huì)降低。這兩個(gè)工藝參數(shù)是細(xì)胞評(píng)估的關(guān)鍵指標(biāo)，并已被廣泛用于大型培養(yǎng)平臺(tái)，包括搖瓶和生物反應(yīng)器。但大規(guī)模培養(yǎng)勞動(dòng)強(qiáng)度大，耗時(shí)長。

S.NEST微生物反應(yīng)器的開發(fā)目的是通過在較小的范圍內(nèi)提供強(qiáng)大的實(shí)時(shí)監(jiān)控來解決這些挑戰(zhàn)。它有四個(gè)腔室，每個(gè)腔室由加熱模塊、水托盤、濕度和二氧化碳傳感器組成，以獨(dú)立控制每個(gè)腔室的環(huán)境(圖1A)。可利用S.NEST蓋子實(shí)現(xiàn)細(xì)胞的混合培養(yǎng)。專利蓋子上的冷凝設(shè)計(jì)能有效地減少蒸發(fā)(圖1B)。S.NEST蓋子的96或24流體通道可以通過氣動(dòng)混合使培養(yǎng)基更均勻(圖1C)并通過固定在微孔板底部的光學(xué)傳感器點(diǎn)監(jiān)測(cè)DO和pH(圖1D)。

圖1  (A) S.NEST培養(yǎng)系統(tǒng)包含4個(gè)獨(dú)立的腔室。(B)可消耗的S.NEST蓋子，帶有防止蒸發(fā)的冷凝設(shè)計(jì)。(C)S.NEST蓋子混和培養(yǎng)基，使培養(yǎng)體系更加均勻。(D) S.NEST系統(tǒng)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)DO和pH。傳感器點(diǎn)附著在微孔板底部。

細(xì)胞分別以2.5x10⁵ /mL、5x10⁵ /mL和1x10⁶ /mL的密度接種于24孔板中，并加入培養(yǎng)基作為對(duì)照(圖2A)。連續(xù)監(jiān)測(cè)8 天 DO和pH。我們發(fā)現(xiàn)每個(gè)DO和pH曲線都有兩個(gè)轉(zhuǎn)折點(diǎn)。各組的DO和pH曲線在開始時(shí)均下降(圖2)。各DO和pH組的性能下降與細(xì)胞密度有關(guān)。高接種密度組的DO和pH下降趨勢(shì)大于低接種密度組(圖2A)。在第一個(gè)轉(zhuǎn)折點(diǎn)，DO和pH的下降曲線變平緩，可能是由于細(xì)胞生長狀況和細(xì)胞代謝的變化。在培養(yǎng)期后期，觀察到第二個(gè)轉(zhuǎn)折點(diǎn)，各組的DO和pH曲線呈上升趨勢(shì)，與細(xì)胞接種密度呈正相關(guān)(圖2A)。為了檢驗(yàn)DO和pH曲線是否與細(xì)胞生長曲線相關(guān)，測(cè)量細(xì)胞生長和活率。接種密度較高的細(xì)胞總細(xì)胞密度(TCD)和活細(xì)胞密度(VCD)較高，但在培養(yǎng)期結(jié)束時(shí)，細(xì)胞活力較低(圖2B)。

在第4天，2.5x10⁵ cells/mL、5x10⁵ cells/mL和1x10⁶ cells/mL的接種組中，倍增時(shí)間分別為41.102和136 h(圖2B)。由于在DO和pH曲線上觀察到兩個(gè)轉(zhuǎn)折點(diǎn)，我們進(jìn)一步研究了轉(zhuǎn)折點(diǎn)與細(xì)胞生長曲線和代謝之間的關(guān)系。

圖2 (A)細(xì)胞密度接種示意圖。不同細(xì)胞密度下DO和pH曲線數(shù)據(jù)。(B)每隔2天測(cè)定并分析細(xì)胞總密度、活細(xì)胞密度、活率和倍增時(shí)間。數(shù)據(jù)以平均值±SEM表示。

結(jié)果顯示DO值下降到80%左右，細(xì)胞倍增時(shí)間約為30小時(shí)(圖3A-C)。與細(xì)胞接種密度有關(guān)，1 M/mL的細(xì)胞接種密度倍增時(shí)間最短，表明細(xì)胞生長最快。當(dāng)細(xì)胞活率下降到90%左右時(shí)，DO值開始增加(圖3D-F)。起始細(xì)胞密度越大，轉(zhuǎn)折點(diǎn)出現(xiàn)的越早，表明細(xì)胞生長受到的阻力越大。

圖3 (A-C)用倍增時(shí)間分析不同接種密度下DO曲線的第一拐點(diǎn)。(D-F)分析DO的第二個(gè)轉(zhuǎn)折點(diǎn)，并與細(xì)胞活率進(jìn)行比較。所有數(shù)據(jù)均以均數(shù)±SEM表示。

影響pH的主要原因是細(xì)胞代謝，因此測(cè)定了不同實(shí)驗(yàn)組培養(yǎng)基中的葡萄糖和葡萄糖的含量。結(jié)果顯示pH出現(xiàn)第一個(gè)拐點(diǎn)時(shí)，培養(yǎng)基中乳酸和葡萄糖的量基本接近，葡萄糖含量為初始值的0.5倍(圖4A-C) 。當(dāng)出現(xiàn)第二個(gè)拐點(diǎn)時(shí)，葡萄糖基本消耗完畢，而乳酸開始成為主要的供能物質(zhì)(圖4D-F)，因此pH開始上升。

圖4  pH值受細(xì)胞代謝的影響。收集部分培養(yǎng)基進(jìn)行葡萄糖和乳酸濃度分析。(A-C) pH曲線的第一個(gè)拐點(diǎn)與葡萄糖和乳酸濃度有關(guān)。(D-F) pH曲線的第二個(gè)拐點(diǎn)與代謝轉(zhuǎn)換有關(guān)。所有數(shù)據(jù)均以均數(shù)±SEM表示。

利用S.NEST微型生物反應(yīng)器可以優(yōu)化細(xì)胞培養(yǎng)流程，例如克隆選擇，補(bǔ)料批量培養(yǎng)和培養(yǎng)基優(yōu)化。在本研究中，我們證明了DO和pH值在不取樣的情況下對(duì)生長動(dòng)力學(xué)和細(xì)胞代謝的評(píng)估意義，同時(shí)也證明了S.NEST培養(yǎng)系統(tǒng)的可靠性。如果在執(zhí)行最佳克隆選擇和其他動(dòng)態(tài)過程(如細(xì)胞培養(yǎng)工藝開發(fā)、提高抗體生產(chǎn)率)期間將具有DO和pH監(jiān)測(cè)功能的系統(tǒng)應(yīng)用于工作流程，則有巨大的參考價(jià)值。

24孔板上監(jiān)測(cè)的DO和pH數(shù)據(jù)還為后期在大型生物反應(yīng)器中培養(yǎng)提供參考，目的是優(yōu)化生長動(dòng)力學(xué)和細(xì)胞活性。除了優(yōu)化CLD外，S.NEST培養(yǎng)系統(tǒng)在簡化T細(xì)胞擴(kuò)增制造過程和pH敏感藥物藥代動(dòng)力學(xué)方面顯示出巨大的潛力。S.NEST的高通量特性與統(tǒng)計(jì)學(xué)工具(如實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方法)相結(jié)合，在工藝開發(fā)中優(yōu)化工藝參數(shù)方面顯示出巨大的前景。