癌癥干細胞假說認為，腫瘤由一小群表現出干細胞特性的細胞驅動和維持。研究人員依賴于腫瘤球形成實驗來識別和擴增這些癌癥干細胞[1]。腫瘤球是來自癌癥干細胞的固態球形細胞形成，不是由其他來源的細胞聚集而成。這些細胞可在無血清、非粘附條件下生長，并且可以在體外用于表征癌癥干細胞群體[2]。
MCF-7是一種模型乳腺癌研究細胞系，用于乳腺球測定，用CD44和CD24等標記物檢測癌癥干細胞特性。乳腺球發育的關鍵步驟是分離單細胞，然后計算成球效率(SFE)[3]。在傳統的腫瘤球形成實驗中，細胞的接種密度通常在每毫升1,000到100,000個細胞之間變化，而不是僅從干細胞中生長，這可能導致細胞聚集而非真正的腫瘤球形成[4,5]。為了提高腫瘤球的單細胞起源比例，理想的接種方式是每個孔中只接種一個細胞。然而，這在技術上是一個挑戰，因為需要精確地分離和放置單個細胞，同時避免細胞損傷。
WOLF G2單細胞柔性分選系統
單細胞分選的創新應用
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NanoCellect Biomedical, Inc. 推出的WOLF G2單細胞柔性分選系統，通過其N1 Single Cell Dispenser，能夠通過分離具有特定標記的細胞，高效地獲取癌癥干細胞，并通過在每個孔中精確沉積單個相關細胞來提高腫瘤球形成效率。
MCF-7 (ATCC HTB-22)細胞在T75瓶中生長，培養基由DMEM、10%FBS及1% antibiotic-antimycotic組成。使用0.05%胰蛋白酶-EDTA制備成單細胞懸浮液，與4℃保存。MCF-7細胞和SpectraComp補償Beads用PE小鼠抗人CD24和FITC小鼠抗人CD44染色，在細胞染色之前，用Human TruStain FcX-FC受體阻斷液阻斷MCF-7細胞10分鐘，然后用抗體染色。使用DRAQ7 (Invitrogen #D15107)作為活性染料，從分類中排除死細胞。
使用補償Beads創建補償矩陣以校正熒光通道溢出，使用單染色對照設置適當的門以從表達CD44high/CD24low的群體中進行分類(圖1)。使用WOLF G2對MCF-7細胞以1 x10^5細胞/mL的濃度進行分選，并將單個細胞分選至預先填充有200 μL完全克隆介質的96孔超低附著板中，完全克隆介質由MammoCult Human Medium Kit組成，補充有4 μg/mL肝素和0.48 μg/mL氫化可的松。分選后，板子在37°C和5% CO2條件下孵育前，以100 x g離心3分鐘。
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圖1. 從MCF-7細胞中篩選乳腺球生成細胞的圈門策略：對腫瘤干細胞標記CD44high/ CD24low的人群進行分類需要適當的圈門。A.創建了一個樣品門，以排除碎片，B.緊接著圈單細胞門以排除雙細胞，C.將單細胞門應用于死活圖以排除死細胞，然后將其應用于CD44-FITC和CD24-PE 的雙變量圖，D.從雙變量圖中，制作一個包含CD44high/CD24low細胞的門來進行排序，在藍色門中突出顯示。
作為對照，使用額外的單細胞盒將10個細胞/孔沉積，以復制當前技術。細胞沉積在預先填充有200 μL克隆介質的96孔板上，隨后在37°C和5% CO2條件下孵育前，以100 x g離心3分鐘。
在第0天、第4天和第7天觀察板子，并在第4天更換介質，即去除100 μL的廢介質并補充100 μL新鮮克隆介質。使用相差顯微鏡（ECHO Revolve）在10倍放大下追蹤沉積細胞的生長。此外，使用5 μM的Calcein AM和25 μg/mL的碘化丙啶（PI）對球體進行染色，并使用FITC和TRITC濾光片（ECHO Revolve）在10倍放大下進行可視化。
在第7天手動計數每個孔中的乳腺球數量，并與第0天沉積的細胞數量進行比較，以找出起源于單個細胞的乳腺球。將此數量除以板上的孔總數，以確定SFE。使用1個細胞/孔和10個細胞/孔制備的板子來計算和比較此值。實驗重復三次以確保結果的可靠性和重復性。
1、顯微鏡分析顯示，WOLF G2分選的細胞形成的腫瘤球在第7天平均直徑為42.9 ± 13.2 μm，并且觀察到從第0天、第3天以及第7天的生長（圖2）。第7天的腫瘤球用Calcein AM和碘化丙啶（PI）染色，以可視化活細胞和死細胞。低細胞密度的板顯示出核心區域PI染色較少（圖3A），而10個細胞/孔的接種顯示出更多死細胞區域（圖3B）。
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圖2. 從兩個不同的孔中生長的腫瘤球體的代表性圖像:在第0、4和7天用10倍放大鏡分析乳腺球體。第0天用于確認單細胞沉積，隨后的幾天用于測量整個過程的生長情況。每隔一天更換一次克隆培養基，以滿足球體生長。到第7天，球的平均直徑為42.9 ± 13.2 μm。比例尺，200 μm。
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圖3. 第 7 天染色腫瘤球體的代表圖像：用熒光顯微鏡觀察Calcein AM（綠色）和PI（紅色）染色的腫瘤球。A. 源自單個細胞的球體顯示出明顯的中心，死細胞被可繼續增殖的靜止細胞包圍。B. 然而，源自10個細胞/孔的球體顯示出更多的死亡細胞，增殖邊緣較少。
2、使用WOLF G2進行的單細胞分選結果顯示，第0天只有9.2 ± 2.8%的孔為空，1.5 ± 0.4%的孔含有兩個或更多細胞。到第7天，平均有82.1 ± 2.7%的孔含有腫瘤球，其中80.7 ± 2.7%的腫瘤球起源于單個細胞（圖4）。
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圖4. 單細胞克隆第0天單孔細胞數和第7天腫瘤球生長情況:第0天單孔細胞數平均為89.3 ± 2.9%，第7天單孔細胞繼續生長的平均為80.7 ± 2.7%。
3、第0天1個細胞/孔的腫瘤球的數量是10個細胞/孔的4倍(圖5)。這增加了下游應用所需的起始腫瘤球數量。
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圖5. 1個細胞/孔和10個細胞/孔時的球體形成效率：與10個細胞/孔相比，1個細胞/孔沉積時的球形形成效率更高，是10個細胞/孔的4倍。
WOLF G2單細胞柔性分選系統可以支持免疫腫瘤學和藥物篩選平臺，對進行腫瘤球測定以進一步研究癌癥起到了重要作用。本研究中，WOLF G2單細胞柔性分選系統展示了其在增加每個96孔板的腫瘤球數量方面的效率，由于其能夠隔離特定的目標群體并溫和地分選它們，從而提高了單細胞克隆性。
