DNA的修復功能是維持細胞正常生理功能和穩定遺傳性的重要因素,其中DNA雙鏈斷裂(DSB)的修復機制包括BRCA1/2介導的同源重組(HR)和典型的 DNA-PKcs介導的非同源末端連接(c-NHEJ)。
對c-NHEJ DNA末端修復通路復合物的結構及功能的了解是應對損傷應答修復機制缺陷相關疾病的科學基礎。在該通路中,蛋白Ku70和Ku80形成的異源二聚體(統稱Ku)是最重要的蛋白復合物。
通過電鏡及X射線對蛋白復合物及晶體結構的分析,已經闡明代謝物IP6(六磷酸肌醇)能夠與Ku相互作用,并在原子水平鑒定了其相互作用結合位點。
然而,IP6結合如何影響或調控Ku蛋白復合物的功能,需要通過技術手段進行進一步的研究。
switchSENSE是通過芯片表面的DNA納米桿,實現對分子互作的動力學參數進行測量。相比較傳統的分子互作檢測技術,其優勢主要體現在三個方面:
(1)DNA納米桿攜帶熒光基團,待分析物不需要進行標記;
(2)DNA納米桿可與DNA, 蛋白結合,可進行多種分子模式的互作,包括DNA和DNA結合蛋白,蛋白與蛋白,小分子與蛋白分子結合的相互作用分析;
(3)由于DNA納米桿在芯片上的自由組裝,可進行復雜的三元復合物,雙特異抗體與靶點形成的復合物相互作用分析,解決了傳統技術在此方面的限制。
switchSENSE技術的原理圖如下:
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研究IP6是否對Ku與DNA的結合具有調控作用;
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研究IP6是否對Ku和XLF相互作用具有調控作用;
(1)研究IP6是否對Ku與DNA的結合具有調控作用
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通過switchSENSE技術將48bp片段大小的DNA固定在芯片的DNA納米桿上,將不同濃度的Ku分子溶液流過芯片表面與DNA結合;
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將Ku分子與IP6進行孵育后,流過芯片表面與DNA結合;
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Helix+儀器自動進行結合,解離及親和性的測量。
(2)研究IP6是否對Ku和XLF相互作用具有調控作用
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通過switchSENSE技術將Ku分子結合在芯片表面的DNA納米桿上,將三種不同濃度的XLF分子流過芯片表面;
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將上述三種不同濃度的XLF與IP6分子孵育后,流過芯片表面;
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Helix+儀器自動進行結合,解離及親和性測量。
(1)IP6可以促進Ku與DNA結合的穩定性
IP6與不同濃度的Ku孵育后,與DNA的結合動力學數據
根據數據結果,當缺少IP6時,Ku與DNA結合的動力學參數如下:
Kon:6.94 ± 0.16 10 5 M ?1 s ?1 ,
Koff:2.26 ± 0.03 10 ?3 s ?1
KD:3.25 ± 0.09 nM
當加入IP6后,Ku與DNA結合的動力學參數如下:
Kon:6.35 ± 0.13 10 5M ?1 s ?1
Koff:1.27 ± 0.03 10 ?3 s ?1
KD:1.99 ± 0.06 nM
(2)IP6能夠促進XLF與Ku分子結合的穩定性
根據數據結果,當缺少IP6時,XLF與Ku結合親和性參數如下:
KD1= 3.6 ± 0.6μM,
KD2= 1.9 ± 0.8μM
當IP6存在時,XLF與Ku結合的親和性參數如下:
KD1= 1.2 ± 0.15μM
KD2= 0.13 ± 0.009μM
并且,該技術可以直觀的反應,XLF與Ku結合的雙向性。
IP6可以通過促進Ku分子與DNA的結合,促進XLF分子與Ku分子的親和性,調控c-NHEJ DNA雙鏈斷裂修復通路。對于IP6和Ku分子結合的電鏡及X-射線結果來說, 以DNA納米桿為背景的分子互作技術,可以進一步的研究IP6在調控c-NHEJ通路上的功能機制,為傳統的結構生物學及互作技術提供了一種更加靈活和多樣的技術手段。
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