我們的研究表明，用于細(xì)胞系開發(fā)的 C.BIRD? 微生物反應(yīng)器能夠改善 96 孔培養(yǎng)的哺乳動物細(xì)胞生長情況，并且在細(xì)胞生長曲線和蛋白質(zhì)產(chǎn)量方面與搖瓶培養(yǎng)數(shù)據(jù)極為相似。傳統(tǒng)的細(xì)胞系開發(fā)（CLD）流程由于早期和后期開發(fā)過程中產(chǎn)生的細(xì)胞系特征不一致，需要花費(fèi)大量時間才能找到最優(yōu)克隆。C.BIRD 系統(tǒng)是一種新的細(xì)胞培養(yǎng)創(chuàng)新技術(shù)，通過減少兩個階段之間的細(xì)胞特征差異，并在 CLD 流程的早期提供最佳懸浮培養(yǎng)條件，解決了這一問題。在本研究中，我們使用 C.BIRD 系統(tǒng)和不使用 C.BIRD 系統(tǒng)培養(yǎng)中國倉鼠卵巢（CHO）細(xì)胞系，并比較了生成的細(xì)胞特征與在搖瓶培養(yǎng)環(huán)境中培養(yǎng)的細(xì)胞特征之間的差異。結(jié)果表明，C.BIRD 提高了活細(xì)胞/總細(xì)胞生長和細(xì)胞活力，并且與大規(guī)模搖瓶培養(yǎng)具有出色的可比性。此外，細(xì)胞倍增時間和相對蛋白質(zhì)產(chǎn)量都有顯著提高，且在統(tǒng)計(jì)學(xué)上沒有差異。
生物制藥行業(yè)正在呼吁加快細(xì)胞系開發(fā)（CLD）流程，以便新生物制品能夠更快獲得監(jiān)管部門的批準(zhǔn)。然而，傳統(tǒng)的 CLD 流程可能需要數(shù)月甚至長達(dá)一年的時間才能確定最佳的細(xì)胞克隆。如此漫長的周期的一個原因是在 CLD 的早期階段選擇合適的克隆時遇到了困難。早期細(xì)胞數(shù)量較少，采用靜態(tài)培養(yǎng)。后期則會轉(zhuǎn)變?yōu)閼腋∨囵B(yǎng)，以擴(kuò)大細(xì)胞產(chǎn)品的產(chǎn)量。從靜態(tài)培養(yǎng)到懸浮培養(yǎng)的轉(zhuǎn)變會產(chǎn)生不同的細(xì)胞系特征（生長速率、滴度、代謝特征等）。這阻礙了在早期 CLD 過程中正確細(xì)胞克隆的識別。因此，需要大量的克隆進(jìn)行測試，這增加了 CLD 的成本和所需時間。為了加快開發(fā)進(jìn)程，整個過程中保持一致的細(xì)胞培養(yǎng)條件至關(guān)重要，以便在 CLD 過程中早期識別具有正確且可持續(xù)特征的細(xì)胞克隆。
高通量技術(shù)正越來越多地應(yīng)用于細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)（CLD）流程中。這些技術(shù)能在小規(guī)模的培養(yǎng)皿/試管中提供懸浮培養(yǎng)環(huán)境，并增強(qiáng)氧氣供應(yīng)。在本研究中，我們展示了一種新的系統(tǒng)，即 C.BIRD 微生物反應(yīng)器系統(tǒng)，它能夠在標(biāo)準(zhǔn)的 96 孔板中實(shí)現(xiàn)早期階段的懸浮細(xì)胞培養(yǎng)。C.BIRD 系統(tǒng)結(jié)構(gòu)緊湊，易于放入標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)箱中。它有一個對接站，可容納三套 C.BIRD 系統(tǒng)（圖 1A）。該系統(tǒng)由兩部分組成：頂部的自主控制箱（圖 1B）和帶有 96 個圓柱形管的消耗性 C.BIRD 蓋子（圖 1C）。C.BIRD 蓋子上的管子提供了 96/24 個液流通道，使得在標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞培養(yǎng)板中的每個孔都能吸入和排出空氣。這些通道與氣動連接，并由控制系統(tǒng)驅(qū)動，從而在 96 孔板中每個孔內(nèi)實(shí)現(xiàn) 150 - 200 μL 工作體積的連續(xù)往復(fù)混合（圖 1D）。有了 C.BIRD，就可以在 96 孔板中實(shí)現(xiàn)體積小至 150 - 200 μL 的細(xì)胞培養(yǎng)規(guī)模的三維懸浮培養(yǎng)環(huán)境。C.BIRD 可以模擬振蕩器的作用。在良好的細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境以及從早期階段就加速細(xì)胞系分化（CLD）進(jìn)程的情況下，從而為細(xì)胞更好地生長以及克隆特征的可預(yù)測性提供了新的可能性。
本研究使用了表達(dá) CHO-K1 單克隆抗體的細(xì)胞系。該細(xì)胞系在化學(xué)定義且不含動物成分的培養(yǎng)基（GibCo 公司生產(chǎn)的 CD Hybridoma 培養(yǎng)基 #11279-023）中適應(yīng)懸浮培養(yǎng)。所有實(shí)驗(yàn)均使用標(biāo)準(zhǔn) 96 孔板（德國 Eppendorf 公司產(chǎn)品編號 #0030730011）進(jìn)行。比較研究是在標(biāo)準(zhǔn)靜態(tài)培養(yǎng)基、30 毫升搖瓶培養(yǎng)基（搖瓶轉(zhuǎn)速：130 轉(zhuǎn)/分鐘；軌道半徑：19 毫米）以及 37°C、5% CO2 培養(yǎng)箱環(huán)境中培養(yǎng)的細(xì)胞上進(jìn)行的。細(xì)胞數(shù)量和細(xì)胞活力通過 Bio-Rad 公司的 TC20 自動細(xì)胞計(jì)數(shù)儀進(jìn)行計(jì)數(shù)。在相同條件下不同時間點(diǎn)的細(xì)胞計(jì)數(shù)是在單獨(dú)的培養(yǎng)孔中進(jìn)行的，以確保細(xì)胞生長不受干擾且計(jì)數(shù)準(zhǔn)確性不受影響。比較細(xì)胞生長和蛋白質(zhì)生成情況。使用 Bethyl Lab 公司的 ELISA 試劑盒（E88-104）進(jìn)行滴度測量。數(shù)據(jù)通過非配對 t 檢驗(yàn)、單因素方差分析（ANOVA）進(jìn)行分析。p 值的顯著性如下：0.12（無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，ns），0.033（*），0.002（**），0.0002（***）和 <0.001（****）。數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差的形式呈現(xiàn)。
本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)如圖 2A 所示。我們從 96 孔板（200 μL）到 30 mL搖瓶考察了 mAb CHO-K1 細(xì)胞系在兩種不同規(guī)模下的每日細(xì)胞生長/倍增時間/蛋白質(zhì)產(chǎn)量，并在 96 孔板中比較了兩種不同的培養(yǎng)條件：標(biāo)準(zhǔn)靜態(tài)培養(yǎng)C.BIRD懸浮培養(yǎng)。我們的結(jié)果表明，采用懸浮培養(yǎng)的C.BIRD系統(tǒng)表現(xiàn)出優(yōu)于靜態(tài)培養(yǎng)的優(yōu)越性能，并且與搖瓶培養(yǎng)表現(xiàn)出相似的細(xì)胞系特征。
培養(yǎng)細(xì)胞 5 天后，C.BIRD 懸浮培養(yǎng)和搖瓶培養(yǎng)分別實(shí)現(xiàn)了 4.4×10E6 個細(xì)胞/毫升和 4.9×10E6 個細(xì)胞/毫升的活細(xì)胞密度，而靜態(tài)培養(yǎng)在第 5 天僅達(dá)到 1.2×10E6 個細(xì)胞/毫升（圖 2B）。細(xì)胞密度的 3.5 倍差異表明，與靜態(tài)培養(yǎng)相比，C.BIRD懸浮培養(yǎng)為細(xì)胞生長最大化提供了更理想的生長條件。
同樣，每個條件下的總細(xì)胞密度也呈現(xiàn)出相同的趨勢。96 孔 C.BIRD 培養(yǎng)和搖瓶培養(yǎng)分別實(shí)現(xiàn)了每毫升 5.2×10^6 個細(xì)胞和 5.7×10^6 個細(xì)胞的總細(xì)胞密度，而靜態(tài)培養(yǎng)在第五天僅達(dá)到 2.0×10^6 個細(xì)胞/毫升（圖 2C）。這些數(shù)據(jù)提供了強(qiáng)有力的證據(jù)，表明在 96 孔規(guī)模下，C.BIRD 培養(yǎng)提供了最理想的細(xì)胞生長條件。對三種培養(yǎng)條件的可行性比較表明C.BIRD 培養(yǎng)法的表現(xiàn)優(yōu)于靜態(tài)培養(yǎng)法，其細(xì)胞存活率保持較高水平，與搖瓶培養(yǎng)條件相當(dāng)。C.BIRD 培養(yǎng)法和搖瓶培養(yǎng)法在第 5 天時細(xì)胞存活率仍保持較高水平，分別為 84.3% 和 86.3%。然而，靜態(tài)培養(yǎng)法在第 5 天時細(xì)胞存活率降至 60.3%（圖 2D）。
且與靜態(tài)培養(yǎng)相比，C.BIRD 培養(yǎng)法顯著縮短了細(xì)胞的倍增時間，從 114 小時縮短至 38.5 小時。在搖瓶培養(yǎng)（35.1 小時）和 C.BIRD 培養(yǎng)（38.5 小時）之間，細(xì)胞的分裂時間沒有顯著差異。結(jié)果表明，96 孔 C.BIRD 具有高性能水平，并且能夠在早期提供搖瓶生長條件（圖 2E）。
最后，每種培養(yǎng)條件下的細(xì)胞系蛋白質(zhì)產(chǎn)量呈現(xiàn)出相同的模式。與靜態(tài)培養(yǎng)相比，C.BIRD 培養(yǎng)下的蛋白質(zhì)產(chǎn)量的倍數(shù)變化顯著更高（高 0.7 倍），而 C.BIRD 和搖瓶之間的倍數(shù)變化沒有顯著差異（2.86 倍對 3.21 倍），如圖 2F 所示。
該研究表明，C,BIRD在 96 孔培養(yǎng)環(huán)境中在三個方面改善了哺乳動物細(xì)胞的生長：1）細(xì)胞生長，2）倍增時間，3）蛋白質(zhì)產(chǎn)量。我們還證明C.BIRD系統(tǒng)在細(xì)胞生長曲線和蛋白質(zhì)產(chǎn)量方面與搖瓶培養(yǎng)非常相似。
總之C.BIRD 使細(xì)胞能夠更早地過渡到懸浮細(xì)胞培養(yǎng)，在標(biāo)準(zhǔn) 96 孔板中具有更高的細(xì)胞生長率，這有可能為后續(xù)的 CLD 過程提供更好的向大規(guī)模搖瓶/生物反應(yīng)器條件的轉(zhuǎn)化。
