目前,尚無節(jié)省時間且經(jīng)濟(jì)高效的高通量篩選方法可用于評估細(xì)菌的耐藥性。本研究中建立了一個液滴微陣列(DMA)系統(tǒng),以人類病原體銅綠假單胞菌(P. aeruginosa)為靶標(biāo)篩選抗菌化合物。研究人員基于 DMA 玻片的潤濕性差異,開發(fā)了一種用于生成含有細(xì)菌的納升級微滴陣列的快速方法。使用熒光評估微滴中的細(xì)菌生長情況。這種新方法能夠立即對抗生素庫進(jìn)行篩選。此外,還對來自環(huán)境分離物的多耐藥菌株 P. aeruginosa 49 的耐藥性進(jìn)行了研究。
本研究表明,DMA 平臺在快速形成細(xì)菌微陣列以進(jìn)行高通量藥物篩選方面具有潛力。
圖 1展示了在 DMA 滑片上細(xì)菌接種和增殖的示意性圖示。將水溶液涂布于該滑片上,由于親水性方形區(qū)域與超疏水邊界之間的潤濕性差異,水溶液會自發(fā)地形成一系列分離的微滴(圖 1b)。將 1.5 毫升細(xì)菌懸液置于超疏水親水性陣列上 30 秒,然后將滑片傾斜以形成含有細(xì)菌的微滴。每個 DMA 玻片(7.5 × 2.5 厘米)包含三個含有 196 個親水性方形區(qū)域的微陣列圖案區(qū)(圖 1c)。使用一個 DMA 玻片,在幾秒鐘內(nèi)形成了 588 個微滴,每個微滴代表一個單獨的陣列區(qū),用于后續(xù)的抗菌測試。
用 1 毫米的圖案尺寸評估 DMA 滑片上微滴的分布體積。圖 1d 顯示了微滴體積的高斯分布,超過 80% 的微滴體積在 70 納升至 130 納升之間。基于此信息,在后續(xù)實驗中使用了 90 納升的單個微滴。
使用表達(dá)綠色熒光蛋白(GFP)的銅綠假單胞菌 PAO菌株來評估在 DMA 滑片上接種后的細(xì)菌生長情況。結(jié)果顯示,經(jīng)過孵育后,超過 77% 的液滴體積仍留在 DMA 上。同時也探究了圖案尺寸對細(xì)菌生長的影響,將三種親水性方形圖案尺寸應(yīng)用于 DMA 滑片。放置于具有 1 毫米和 3 毫米親水性斑點的 DMA 滑片上的細(xì)菌在孵育 24 小時后,其熒光均呈現(xiàn)明亮的綠色,與在 96 孔板中生長的細(xì)菌的熒光相當(dāng)(圖 1e)。使用 ImageJ 軟件對細(xì)菌斑點的數(shù)字圖像進(jìn)行熒光強(qiáng)度量化。這里,所有斑點的熒光強(qiáng)度均被標(biāo)準(zhǔn)化為某一基準(zhǔn)值。在 96 孔板中培養(yǎng)細(xì)菌 24 小時后細(xì)菌生長的熒光強(qiáng)度用于探究在小體積條件下細(xì)菌生長是否會受到影響。在具有 0.5 毫米親水性斑點的 DMA 滑片上細(xì)菌的熒光強(qiáng)度為 0.35 ± 0.06 熒光單位,遠(yuǎn)低于 96 孔板中的細(xì)菌熒光強(qiáng)度。這一結(jié)果表明,0.5 毫米親水性斑點的小體積中所含的 P. aeruginosa PAO1 細(xì)胞不足以用于熒光信號評估。因此,使用 1 毫米斑點圖案在一張 DMA 滑片上形成液滴,用于進(jìn)一步的應(yīng)用。DMA 玻片上細(xì)菌的密與在 96 孔板中培養(yǎng)的細(xì)菌密相近(圖 1g)。熒光成像和細(xì)菌密度結(jié)果均證實,具有 1 毫米親水性斑點的 DMA 玻片支持細(xì)菌在單個微滴中的持續(xù)生長。
在篩選過程中采用夾層工藝,先用I.DOT將抗生素分配到玻片上,然后使用 CellScreenChip(CSC)精確地將其置于載有細(xì)菌液滴DMA 載玻片上(圖 2a、b)。圖 2c-h顯示了在 13.5 μm 濃度下使用萬古霉素(對抑制銅綠假單胞菌 PAO1 的生長無效)以及在 40 μm 濃度下使用環(huán)丙沙星(對抑制銅綠假單胞菌 PAO1 的生長有效)進(jìn)行測試的結(jié)果。圖 2c 確認(rèn)了在含有環(huán)丙沙星的液滴(無強(qiáng)烈的綠色熒光)和相鄰含有萬古霉素的液滴(明亮的綠色熒光)之間的夾層過程中不存在交叉污染。每個液滴的熒光強(qiáng)度掃描結(jié)果如圖 2d 所示。此外,我們使用這種夾層方法對液滴進(jìn)行了CTC染色,這種染料在代謝活躍的細(xì)胞中會轉(zhuǎn)化為紅色熒光分子 CTC 形成物。如圖 2e、f 所示,細(xì)菌在液滴中顯示出明亮的紅色熒光.細(xì)菌的生長情況也可以通過視覺進(jìn)行評估,含有細(xì)菌的滴液在干燥后會變得不透明,而沒有高密度細(xì)菌的滴液則會保持透明(圖 2g)。
作為一個抗生素篩選平臺,DMA 應(yīng)該能給出與基于微孔板方法所獲得的結(jié)果相當(dāng)?shù)臄?shù)據(jù)。因此,我們對五種抗生素的 MIC(最小抑菌濃度)進(jìn)行了研究,研究對象是 P. aeruginosa PAO1 菌株,在 DMA 表面以及 96 孔板中進(jìn)行檢測。MIC 是指能夠在基于 OD600 值測定的隔夜實驗中抑制細(xì)菌生長的抗菌化合物的最低濃度。如圖 3 所示,頭孢他啶在 DMA 玻片和 96 孔板上的 MIC 值均在 6 - 60 μm 范圍內(nèi)。環(huán)丙沙星在 DMA 滑片和 96 孔板上的 MIC 值均在 0 - 1 μm 范圍內(nèi)。妥布霉素在 DMA 滑片上的 MIC 值在 2 - 20 μm 范圍內(nèi),而在 96 孔板中的 MIC 值在 0 - 2 μm 范圍內(nèi),盡管這些數(shù)值與 EUCAST 數(shù)據(jù)庫中列出的 MIC 值范圍(0 - 68 μm)一致。氨芐西林和四環(huán)素在 DMA 滑片和 96 孔板中的實驗中均未顯示出對 P. aeruginosa PAO1 有效的抗菌作用。還對多粘菌素 B 在 DMA 滑片和 96 孔板上的抗菌效果的時間依賴性進(jìn)行了研究。如圖 3f 所示,在 DMA 滑片和 96 孔板中,暴露于聚麥迪霉素 B 后活菌數(shù)量隨時間呈時間依賴性減少,使所有細(xì)菌失活,在最初的 2 小時孵育中,在 DMA 滑片上的小液滴體積不影響聚麥迪霉素 B 對銅綠假單胞菌 PAO1 的抗菌效果的動力學(xué)。這些觀察結(jié)果證實了在 DMA 滑片上的小液滴體積不會影響聚麥迪霉素 B 對銅綠假單胞菌 PAO1 的抗菌效果的動力學(xué)。
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