全長(zhǎng)單細(xì)胞RNA測(cè)序（scRNA-seq）是解析可變剪接、等位基因表達(dá)的核心工具，但傳統(tǒng)方法（如Smart-seq3）存在流程耗時(shí)（>7小時(shí)）、鏈入侵artifacts干擾、難以自動(dòng)化迷你化等痛點(diǎn)，限制了高通量樣本分析。FLASH-seq（FS）作為革新性全長(zhǎng)scRNA-seq技術(shù)，通過(guò)優(yōu)化酶促反應(yīng)與試劑設(shè)計(jì)，實(shí)現(xiàn)測(cè)序文庫(kù)4.5小時(shí)快速構(gòu)建，還衍生出低擴(kuò)增版本（FS-LA）和含UMI版本（FS-UMI），靈敏度與基因檢測(cè)數(shù)顯著優(yōu)于傳統(tǒng)方法[1]。其中，I.DOT非接觸式納升級(jí)移液系統(tǒng)為實(shí)驗(yàn)的高通量與精準(zhǔn)性提供關(guān)鍵支撐——通過(guò)納升級(jí)精準(zhǔn)分裝試劑，保障384孔板中每孔反應(yīng)均一性，完美適配自動(dòng)化流程，推動(dòng)FLASH-seq在稀有細(xì)胞分析、isoform鑒定等場(chǎng)景的落地。
實(shí)驗(yàn)方法
核心平臺(tái)與材料設(shè)計(jì)
采用384孔低吸附板（Eppendorf LoBind），選取HEK293T細(xì)胞、人外周血單個(gè)核細(xì)胞（hPBMCs）、18周人視網(wǎng)膜類器官為研究對(duì)象，以Superscript IV逆轉(zhuǎn)錄酶、KAPA HiFi聚合酶為核心酶試劑，設(shè)計(jì)三種實(shí)驗(yàn)方案：①FS（標(biāo)準(zhǔn)版，25 μL/5 μL反應(yīng)體積）；②FS-LA（低擴(kuò)增版，無(wú)中間清潔步驟）；③FS-UMI（含UMI與5 bp間隔子，減少鏈入侵）。主要檢測(cè)指標(biāo)包括基因檢測(cè)數(shù)、比對(duì)效率、isoform鑒定效率、SNP檢測(cè)靈敏度（Figure1a、1e、2a）。
圖1. FS和FS低放大(FS-LA)協(xié)議概述。a，為本研究中使用的全長(zhǎng)scRNA-seq協(xié)議處理96孔HEK293T細(xì)胞的估計(jì)協(xié)議持續(xù)時(shí)間。步驟用顏色編碼。質(zhì)量控制包括濃度和粒度分布測(cè)量。SSSC，SMART-SEQ單細(xì)胞套件(Takara)。b，在兩個(gè)讀取閾值下處理SS2(n=80)、SS3(n=51)和FS(n=105)處理的HEK293T細(xì)胞中檢測(cè)到的基因數(shù)量，其中讀取下采樣到500,000(=500K)原始讀取。c，平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(S.D.)HEK293T細(xì)胞的基因體覆蓋。d，在SS2(n=80)、SS3(n=51)和FS(n=105)中僅使用所有三種方法表達(dá)的基因(n基因=20,042)之間的Kendall‘s tau相關(guān)性。e，F(xiàn)S-LA工作流。所需的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)周期數(shù)是細(xì)胞RNA含量的函數(shù)。f，使用250K下采樣原始讀取處理的HEK293T細(xì)胞中檢測(cè)到的基因數(shù)量?；驒z測(cè)閾值設(shè)置為>；0或>；5讀數(shù)。g，頂部的面板顯示了用FS或FS-LA處理的HEK293T細(xì)胞中映射到外顯子(=CDS外顯子)、內(nèi)含子或基因間特征的閱讀標(biāo)簽的百分比，使用ReSQC測(cè)量。底部面板顯示了FS和FS-LA的映射統(tǒng)計(jì)信息以及唯一映射、多映射或未映射讀取的百分比。h，平均值±S.D.HPBMC樣本中每種細(xì)胞類型檢測(cè)到的基因數(shù)(>；0讀取)。僅顯示兩個(gè)或多個(gè)單元格支持的點(diǎn)。一些細(xì)胞沒有足夠的覆蓋面，無(wú)法在每一個(gè)點(diǎn)上得到代表。在每種細(xì)胞類型的125K讀數(shù)下，使用Wilcoxon秩和檢驗(yàn)(雙側(cè)Bonferroni校正，調(diào)整P值)來(lái)評(píng)估FS和FS-LA中基因數(shù)量的差異。兩組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>；0.05)。MAIT，粘膜相關(guān)不變T細(xì)胞；單核細(xì)胞；NK，自然殺傷細(xì)胞；Tcm，中央記憶T細(xì)胞；TEM，效應(yīng)記憶T細(xì)胞；GDT，γ-增量T細(xì)胞；PDC，漿細(xì)胞樣樹突狀細(xì)胞；cDC2，常規(guī)樹突狀細(xì)胞2。采用雙側(cè)Dunn‘s檢驗(yàn)，并經(jīng)Bonferroni校正，調(diào)整后的P值為b，d和f。f和g中的盒子圖顯示中位數(shù)(中心)，第25/75%百分位數(shù)(下/上鉸鏈)，1.5×四分位數(shù)范圍(胡須)和異常值(點(diǎn))。。
02
關(guān)鍵操作與 I.DOT 的核心應(yīng)用
裂解緩沖液分裝：通過(guò)I.DOT將1μL裂解緩沖液（含Triton-X100、dNTPs、FS-dT30VN引物、RNA酶抑制劑等）精準(zhǔn)分裝至384孔板，密封后-20℃儲(chǔ)存，保障每孔試劑濃度均一，避免交叉污染（對(duì)應(yīng)文獻(xiàn)Methods“Lysis buffer preparation”）。I.DOT的納升級(jí)分配精度（±5%誤差）是后續(xù)反應(yīng)一致性的基礎(chǔ)，尤其適配384孔板的高通量需求。
RT-PCR混合液添加：細(xì)胞分選后，從-80℃取出平板，經(jīng)72℃孵育3分鐘后冰浴，通過(guò)I.DOT向每孔添加4 μL RT-PCR混合液（含Superscript IV、KAPA HiFi ReadyMix、甜菜堿等），實(shí)現(xiàn)逆轉(zhuǎn)錄與cDNA預(yù)擴(kuò)增“一步法”（Figure1e FS-LA workflow）。I.DOT的自動(dòng)化添加避免手動(dòng)操作誤差，提升實(shí)驗(yàn)重復(fù)性，且支持1-384孔靈活適配，契合高通量測(cè)序需求。
三種版本實(shí)驗(yàn)流程：①FS：RT-PCR后經(jīng)磁珠清潔、QC、標(biāo)簽化；②FS-LA：RT-PCR后直接取1μL cDNA進(jìn)行標(biāo)簽化，無(wú)清潔步驟；③FS-UMI：RT-PCR混合液中加入含UMI和間隔子的TSO，減少鏈入侵（Figure2a）。
圖2. 在FS-UMI中，鏈入侵事件得到緩解。a，鏈切換反應(yīng)發(fā)生在cDNA末端(上)；當(dāng)UMI和核苷序列相鄰時(shí)(中)，鏈入侵事件增加，但被間隔區(qū)序列減輕(下)。b，使用UMI在HEK293T細(xì)胞中檢測(cè)到的基因數(shù)量與幾個(gè)下采樣測(cè)序深度(NSS3=85，NSS3_Hagemann-J)的內(nèi)部讀數(shù)之間的關(guān)系。=101、NFS-CTAAC_STRT-DT=76、NFS-CAGCA_STRT-DT=16)。藍(lán)線表示FS中檢測(cè)到的平均基因數(shù)(μL=85，75K讀數(shù))。紫色/粉紅色線條表示在SS3中檢測(cè)到的基因的平均數(shù)量(Hagemann-Jensen等人5，UMI=粉色，INTERNAL=紫色，75K讀數(shù))。比較兩種讀數(shù)類型(雙側(cè)Wilcoxon秩和檢驗(yàn)，Bonferroni調(diào)整P值，按讀數(shù)類型著色)5和其他條件下在75K讀數(shù)時(shí)檢測(cè)到的基因數(shù)量。c，使用500K隨機(jī)選擇的UMI(HEK293T)，在讀出開始附近的6-堿基對(duì)中的核苷酸分布。d，均值±S.D.去重復(fù)的UMI讀數(shù)(%)包含UMI與上游序列之間的匹配，在20個(gè)堿基對(duì)內(nèi)，有0到3個(gè)連續(xù)的5‘不匹配(NSS3=2,089,581，NSS3_Hagemann-J)。=13,511,157，NFS-UMI-TSO_STRT-dt=1,404,599，NFS-CTAAC_STRT-dt=9,964,516，NFS-CAGCA_STRT-dt=1,189,676，UMI讀取)。e，通過(guò)寡聚-DT/TSO組合著色。視網(wǎng)膜器質(zhì)與實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。視網(wǎng)膜和非視網(wǎng)膜部分突出顯示。f，使用10x基因組學(xué)和FS-UMI(UMI，內(nèi)部或兩者同時(shí)讀取)在典型細(xì)胞類型中檢測(cè)到(>；0讀取)基因。Dunn‘s檢驗(yàn)(雙側(cè)，Bonferroni調(diào)整P值)。雙極開，開中心雙極電池；雙極關(guān)，偏離中心的雙極電池。g、基因多樣性。通過(guò)對(duì)每種細(xì)胞類型的10個(gè)細(xì)胞重新采樣100次，并計(jì)算在兩個(gè)以上細(xì)胞中使用>；0讀取(包括UMI/內(nèi)部讀取)表達(dá)的基因的數(shù)量。h，平均值±S.D.在不同的下采樣讀取深度檢測(cè)到SNPs(nsf_retinalods=1,281)。對(duì)于每個(gè)細(xì)胞，轉(zhuǎn)錄區(qū)域的外顯子組SNPs測(cè)序(測(cè)序深度(=dp)和gt；2)作為參考。在FS-UMI(綠色，DP&>2)或參考(粉色)中檢測(cè)到的SNPs總數(shù)。在FS-UMI和參照物(橙色，DP>；2；紫色，DP>；2和變異質(zhì)量(=QUAL)>；20)中檢測(cè)到真陽(yáng)性SNPs。假陰性SNP，F(xiàn)S-UMI中未檢測(cè)到參考SNP(深綠色)。假陽(yáng)性SNPs，在FS-UMI中檢測(cè)到，但在參考文獻(xiàn)中不存在(黃色，DP>；2；Brown，DP>；2&QUAL>；20)。真陽(yáng)性SNPs(%)，在參考SNPs中檢測(cè)到的真陽(yáng)性SNPs的百分比。f和g中的框圖顯示了中位數(shù)(中心)、25%/75%(下/上鉸鏈)、1.5×四分位數(shù)范圍和異常值(點(diǎn))。
檢測(cè)與分析：測(cè)序采用Illumina NextSeq 550，數(shù)據(jù)經(jīng)STAR比對(duì)、featureCounts計(jì)數(shù)、Seurat聚類分析，評(píng)估基因檢測(cè)數(shù)、isoform多樣性、SNP檢出率（Figure1f-h、2f-h）。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果
速度與靈敏度雙突破，遠(yuǎn)超傳統(tǒng)方法
FLASH-seq全程僅需4.5小時(shí)，比Smart-seq3短2-3.5小時(shí)（圖1a），且在HEK293T細(xì)胞中檢測(cè)到的基因數(shù)顯著高于Smart-seq2和Smart-seq3（圖1b），即使測(cè)序深度降低至500K raw reads，仍能捕獲更多蛋白編碼基因和長(zhǎng)鏈基因。FS-LA版本省去中間清潔與QC步驟，上手時(shí)間<1小時(shí)，且HEK293T細(xì)胞10-12個(gè)PCR循環(huán)即可獲得高質(zhì)量文庫(kù)，hPBMCs僅需14-16個(gè)循環(huán)（圖1f-g），靈敏度與標(biāo)準(zhǔn)FS相當(dāng)。
迷你化與自動(dòng)化適配，I.DOT 助力高通量精準(zhǔn)反應(yīng)
將FS反應(yīng)體積從25 μL迷你至5 μL后，HEK293T細(xì)胞基因檢測(cè)數(shù)無(wú)下降，hPBMCs中CD14?單核細(xì)胞、na?ve CD8?T細(xì)胞的基因檢測(cè)數(shù)反而顯著提升。這一迷你化成功得益于I.DOT的納升級(jí)精準(zhǔn)分配——384孔板中每孔裂解緩沖液與RT-PCR混合液的體積變異系數(shù)<3%，避免了手動(dòng)分裝的誤差，為自動(dòng)化高通量測(cè)序提供了技術(shù)支撐。
FS-UMI減少鏈入侵，提升isoform與SNP檢測(cè)能力
FS-UMI通過(guò)在TSO中加入8nt UMI和5 bp間隔子，顯著降低鏈入侵artifacts：與Smart-seq3相比，其UMIreads中“GGG” motif鄰近比例下降，上游序列匹配率從>10.9%降至<4.25%（圖2c-d）。在250K raw reads下，F(xiàn)S-UMI比Smart-seq3多檢測(cè)8±4.3%的基因和18±6.1%的isoform（圖2b），且能在視網(wǎng)膜類器官中檢測(cè)到4.1±2.9倍更多的細(xì)胞類型標(biāo)記基因（圖2f）。此外，F(xiàn)S-UMI還能在單細(xì)胞水平捕獲SNP，在視網(wǎng)膜類器官中61.57±1.7%的外顯子SNP可被驗(yàn)證（圖2h）。
多場(chǎng)景應(yīng)用驗(yàn)證，適配稀有細(xì)胞與復(fù)雜樣本
在hPBMCs中，F(xiàn)S成功重構(gòu)TCR重排，稀有細(xì)胞（如MAIT細(xì)胞、pDC細(xì)胞）的基因檢測(cè)數(shù)與主要細(xì)胞類型相當(dāng)（SupplementaryFig.3a）；在18周視網(wǎng)膜類器官中，F(xiàn)S-UMI比10x Genomics檢測(cè)到更多基因和更高基因多樣性（圖2f-g），精準(zhǔn)注釋出OFF-center雙極細(xì)胞（GRIK1?）、無(wú)長(zhǎng)突細(xì)胞前體（PTF1A?）等稀有細(xì)胞類型，還能區(qū)分PKM1/PKM2兩種剪接異構(gòu)體，而10x Genomics無(wú)法區(qū)分該isoform。
總結(jié)與討論
本研究開發(fā)的FLASH-seq技術(shù)，以“快速、高敏、低artifact”重塑全長(zhǎng)scRNA-seq范式，而I.DOT非接觸式納升級(jí)移液系統(tǒng)是其實(shí)現(xiàn)高通量、自動(dòng)化、迷你化的關(guān)鍵支撐——通過(guò)納升級(jí)精準(zhǔn)分裝裂解緩沖液與RT-PCR混合液，解決了微量反應(yīng)中體積不均一、交叉污染的痛點(diǎn)，使384孔板高通量測(cè)序成為可能，大幅降低實(shí)驗(yàn)成本與上手難度。
技術(shù)突破體現(xiàn)在三方面：①速度革新：4.5小時(shí)完成文庫(kù)構(gòu)建，F(xiàn)S-LA版本上手時(shí)間<1小時(shí)，遠(yuǎn)超Smart-seq3；②artifact抑制：FS-UMI的間隔子設(shè)計(jì)減少鏈入侵，提升isoform與SNP檢測(cè)準(zhǔn)確性；③靈活適配：迷你化至5μl仍保持高靈敏度，兼容hPBMCs、視網(wǎng)膜類器官等復(fù)雜樣本，尤其適合稀有細(xì)胞分析。
與傳統(tǒng)方法相比，F(xiàn)LASH-seq兼具全長(zhǎng)覆蓋優(yōu)勢(shì)與droplet方法的高通量潛力，成本<1美元/細(xì)胞，且I.DOT的自動(dòng)化適配使其易整合到實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)有高通量平臺(tái)。未來(lái)可進(jìn)一步拓展至臨床樣本快速檢測(cè)、單細(xì)胞多組學(xué)聯(lián)合分析等場(chǎng)景，而I.DOT等精準(zhǔn)分配技術(shù)的應(yīng)用，也為測(cè)序技術(shù)的迷你化、自動(dòng)化發(fā)展提供了可復(fù)用范式，推動(dòng)全長(zhǎng)scRNA-seq從基礎(chǔ)研究走向臨床轉(zhuǎn)化。
參考文獻(xiàn)
1、Hahaut V, Pavlinic D, Carbone W, Schuierer S, Balmer P, Quinodoz M, Renner M, Roma G, Cowan CS, Picelli S. Fast and highly sensitive full-length single-cell RNA sequencing using FLASH-seq. Nat Biotechnol. 2022 Oct;40(10):1447-1451.
