在腫瘤學領域，單細胞生物學已成為研究細胞異質性和癌癥生物學所涉及的細胞信號通路（如免疫耐受）的重要工具。單細胞轉錄組學尤其被用于了解腫瘤細胞的復雜性以及與疾病進展和治療反應（包括耐藥性）相關的特定生物標記物。然而，單細胞轉錄組學的質量在很大程度上依賴于細胞分離和樣本制備，以保持RNA的質量，并在生成cDNA和制備文庫之前去除死細胞和碎片。流式分選可用于收集特定細胞群，并清除死亡或瀕死細胞。然而，使用高壓液滴形成的傳統細胞分選方法會進一步損傷細胞，導致基因表達變化或RNA整體降解。此外，傳統高壓流式會產生具有生物危害性的氣溶膠，存在樣本間交叉污染的風險。
WOLF柔性單細胞分選儀是一種低壓微流體細胞分選儀（>2 psi），用于溫和地分選細胞，不會像傳統流式高壓噴嘴形成液滴，采用可拋棄式微流控芯片，進一步降低了生物危害，因此樣本和鞘液接觸到的一切都是無菌、一次性的，不會造成樣本間的污染。為了展示這種溫和的無菌細胞分選儀如何影響 10x 基因組學工作流程中的單細胞 RNA 轉錄組學，我們與一家大型癌癥中心的學術流式細胞儀核心合作，比較未分選的小鼠前列腺細胞與NanoCellect WOLF細胞分選儀和BectonDickenson FACSAriaTM II分選的細胞的樣本。
下圖顯示了兩種分選儀的分選圖。100,000個細胞在BD FACSAria II和NanoCellect WOLF上進行分選。然后大約5000個細胞進入10x Chromium Controller。將RNA轉化為cDNA，使用Chromium Single Cell 3' v3 Kit生成文庫，并使用Illumina進行測序。所有樣本都用10x Genomics Cell Ranger Pipeline進行分析以檢測測序結果的質量。在不同的日期進行了三次獨立實驗（每次實驗3-5只小鼠）。BD FACSAria II和NanoCellect WOLF樣品在同一天進行平行分選和測序處理。BD FACSAria II分選兩個樣本，因為一個BD FACSAria II分選樣本產生的結果不具可比性。
在所有三種條件下，10x Genomics Chromium Controller 的細胞均回收5,000個細胞：1）未分選樣本；2）BD FACSAria II分選樣本；3）NanoCellect WOLF分選樣本?；厥占毎臄盗渴軒讉€因素的影響：無活力細胞的百分比、細胞聚集以及細胞濃度的高估/低估。總結顯示，未分選樣本平均回收了3064個細胞，BD FACSAria II分選樣本平均回收了4440個細胞，NanoCellect WOLF分選樣本平均回收了4955個細胞（下圖A）。未分選樣本的細胞回收率最低，而WOLF分選樣本的細胞回收率最接近目標數量。由于未分選樣本中含有可被算作細胞的碎屑和死細胞，這可能導致高估了裝載的存活細胞，從而導致未分選樣本和BD FACSAria II樣本中回收的細胞數量較少。
每個細胞的基因中位數和每個細胞的唯一分子標識符（UMI）中位數都是衡量文庫復雜性的指標。WOLF分選樣本的每個細胞基因中位數（1,711個）和每個細胞獨特分子標識符中位數（4,932個，下圖B，C）平均最高。Cell Ranger Summary還顯示了與細胞無關的讀數比例，這是無細胞污染RNA的指標。在這一指標中，WOLF分選樣本與細胞無關的讀數百分比最低（10.3%），而未分選樣本的百分比最高，這與較高的碎片和死細胞存在率（19.2%）一致（下圖D）。這些結果表明，經WOLF分選的樣本中來自碎片和死細胞的污染RNA數量最少。
條形碼等級圖通過顯示 1）與細胞相關的條形碼；2）來自空分區的條形碼之間是否存在明顯的分隔，來幫助評估RNA的完整性。與活細胞相關的條形碼的UMI計數應大大高于無細胞或低質量細胞的背景條形碼。因此，在RNA質量較高的樣本中，UMI計數和條形碼之間會出現陡峭的斜坡或下降。下圖顯示了每個樣本的UMI與條形碼對比圖，與未分選的對照樣本相比，在BD FACSAria II和WOLF分選樣本中可以觀察到更陡峭的斜坡或彎頭（高亮圓圈）。這些結果表明，在10x Genomics工作流程的上游使用細胞分選儀可提高RNA質量，同時減少來自無細胞來源的污染RNA。WOLF分選樣本的UMI計數也更高，反映出細胞分選過程對細胞的損傷更小。
該實驗表明，使用BD FACSAria II或WOLF進行樣本制備，可減少碎片和死細胞對RNA的影響，從而獲得更高質量的scRNA測序結果。此外，這些數據還表明，使用細胞分選儀去除死細胞和碎片可提高細胞計數的準確性。
雖然WOLF和BD FACSAria II分選的樣本都能產生較高的文庫復雜度和較低的與條形碼無關的讀數，但WOLF分選的樣本顯示出最有利的結果，與傳統的液滴式細胞分選儀相比，使用簡單易用的微流控細胞分選儀進行樣本富集的RNA完整性更高。因此，在10x基因組學工作流程中使用溫和的細胞分選儀（如WOLF細胞分選儀）進行細胞分選是產生高質量scRNA測序結果的更有利的方法。
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