隨著能夠解析單細胞信息的微流控和基因檢測工具的日益普及，對生物學的認識也在不斷深入。更重要的是，實現單細胞RNA測序的能力可以對單個細胞進行轉錄組分析，并以高生物分辨率提供有關流行性、異質性和基因表達的信息。然而，大多數實驗室缺乏將單細胞正確分選到96孔板或384孔板的工具，也沒有能力制定復雜的RNA-Seq方案。通過將WOLF細胞分選儀（NanoCellect）和QIAseq UPX 3' RNAseq試劑盒（QIAGEN）這兩種技術結合起來，我們制定了一套完整的工作流程解決方案，相較于傳統方法更加簡便，提高了單細胞RNA-Seq檢測能力和實驗靈活性。
在此，我們將概述完整的工作流程：從細胞檢測、單細胞分選到使用QIAseq UPX試劑盒進行單細胞RNA-Seq實驗設計。此外，我們還舉例說明了典型的數據分析工作流程：從處理FCS流式數據到使用GeneGlobe NGS分析中心的集成云進行RNASeq數據分析。
傳統的細胞分揀機使用高壓氣溶膠-電場偏轉技術，而WOLF則不同，它使用微流控細胞分選技術，在小于2 psi的壓力下溫和地分揀細胞。WOLF使用蠕動泵和低壓壓電硒鼓，將細胞準確地分揀到2個不同的腔室（下圖A）。微流控是一次性無菌使用的，與細胞培養基等特定應用緩沖液兼容。這樣就不會發生樣品交叉污染，樣品接觸到的所有東西都是完全一次性的（下圖B）。此外，WOLF和N1單細胞分裝機的體積不到2立方英尺，可以直接放置在生物安全柜中，實現完全無菌的環境，降低污染風險（下圖C）。此外，WOLF還支持富集分選和單細胞分選兩種模式（下圖D）。
N1可將1至100個細胞直接分裝到96或384孔板中。此外，與細胞打印機和有限稀釋法相比，WOLF和N1有5個檢測參數，可提供更高的單細胞檢測率和活死細胞分辨率。為了證明WOLF從死亡細胞和碎片中分選出有活力細胞的能力，將熱處理（死亡）的CHO細胞和健康的CHO細胞按50:50的比例混合，分選后分配到96孔板中。混合細胞用碘化丙啶染色，以標記死細胞。然后用WOLF從樣品中分辨出死細胞（下圖A）。分析結果顯示，60%的細胞為死細胞。分選后的分析表明，WOLF能夠將死細胞/碎片減少到只有6%（下圖B）。然后根據PI陰性/存活細胞門將健康的CHO細胞分選到96孔細胞培養板中（下圖B）。使用Synentec NyOne成像儀分析單細胞噴點效率（下圖C）。共分析了9個板。結果顯示，WOLF-N1在96孔板上的單細胞噴點效率平均為85%。這些結果與分選對照相似（下圖D），表明WOLF-N1平臺能夠溫和地分選細胞，而不會造成細胞死亡。
WOLF-N1平臺除了能在孔板上分選外，還能直接在PCR板上分選，WOLFviewer軟件能檢測分裝的單細胞的熒光強度（下圖A、B）。為了確定和比較N1的分揀效率，將beads分配到8個96孔培養板（對照）和13個96孔PCR板中。細胞培養板和PCR板的分選效率差異不大（下圖C）。細胞培養板的平均置板率為98%，而PCR板的平均置板率為90%。此外，單細胞置板率是根據每孔檢測到的基因轉錄組數量確定的。使用N1分選兩板293T細胞，然后使用Qiagen UPX 3'轉錄組試劑盒完成文庫制備。每孔估計細胞數定義為：<100個基因= 0個細胞，100-1499個基因=每孔1個細胞，1500個以上基因=每孔2個或更多細胞。我們估計，在96孔板中，1號板72%的孔有1個細胞，2號板92%孔有1個細胞（下圖B）。這些結果表明，N1能夠成功地將單個細胞培養到PCR板中，并產生單細胞RNA測序結果。
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