在生物學(xué)，便攜式DNA測(cè)序，無(wú)標(biāo)記單分子分析和納米醫(yī)學(xué)方面，膜納米孔都體現(xiàn)了其重要的應(yīng)用價(jià)值。傳統(tǒng)的物質(zhì)運(yùn)輸，其依賴于膜上數(shù)納米寬的桶狀通道，但是科技發(fā)展的需求，需要在形狀上可調(diào)控的，更加寬的納米通道，以適應(yīng)更廣泛的應(yīng)用。而在天然狀態(tài)下，并不存在這種類的納米孔。利用蛋白合成該類型的納米通道，也具有極大的挑戰(zhàn)性。本文介紹了利用DNA進(jìn)行上述結(jié)構(gòu)可調(diào)和功能應(yīng)用多樣化的膜納米孔的設(shè)計(jì)。該設(shè)計(jì)將成束的DNA雙鏈制備成構(gòu)成膜孔的亞單位，并逐步組裝成形狀上可調(diào)節(jié)的完整性膜孔，該孔的寬度可達(dá)幾十納米。用于識(shí)別或信號(hào)連接的功能單位，可以與該納米孔進(jìn)行結(jié)合。通過(guò)現(xiàn)有儀器設(shè)備和檢測(cè)手段，本文證明了該定制化的納米孔在電介導(dǎo)的10nm大小的單分子蛋白的檢測(cè)上應(yīng)用潛能，并顯示了在合成生物學(xué)，單分子酶學(xué)和生物物理分析以及便攜式診斷，環(huán)境檢測(cè)等方面，該DNA納米結(jié)構(gòu)如何實(shí)現(xiàn)對(duì)功能性分子的傳遞作用。

膜納米孔的的腔面性質(zhì)或參數(shù)決定了其生物學(xué)功能。在納米孔對(duì)物質(zhì)的感應(yīng)中，通道的寬度調(diào)控著單個(gè)分子的進(jìn)入及通過(guò)的過(guò)程，并因此影響了由于物質(zhì)通過(guò)引起的電信號(hào)。因此，1-5nm寬度的蛋白孔通道能夠感應(yīng)相同大小的DNA鏈，有機(jī)分子和小分子量蛋白。而克服當(dāng)前由于通道寬度帶來(lái)的限制，是膜納米孔研究領(lǐng)域的重大突破。例如，更寬的納米孔能夠在單分子水平上，更快轉(zhuǎn)移，直接的感應(yīng)及檢測(cè)分子量更大的酶，免疫球蛋白，蛋白復(fù)合物或病毒。并且，在形狀上，突破傳統(tǒng)的圓柱形通道設(shè)計(jì)，能夠更好的應(yīng)用于不同形狀的底物。并且，該納米孔應(yīng)能夠連接特異性的分子受體，提高分子識(shí)別和結(jié)合的特異性。最后，該二代納米孔，應(yīng)能夠和當(dāng)前的電信號(hào)檢測(cè)設(shè)備兼容，比如用于便攜式DNA測(cè)序的MinlON，目前為止，該技術(shù)還未應(yīng)用于蛋白分子的檢測(cè)中。除了分子感應(yīng)，納米孔還可以應(yīng)用于合成的細(xì)胞，細(xì)胞打孔以用于生物活性物質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)。目前為止，由于氨基酸較小以及多肽折疊成特定蛋白結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性，還未有蛋白，肽等構(gòu)建的符合需求的二代膜納米孔。由于核酸分子具有簡(jiǎn)單的堿基互補(bǔ)配對(duì)法則和較容易預(yù)測(cè)的DNA折疊性質(zhì)，DNA成為了構(gòu)建該二代納米孔的可替代材料。確實(shí)，已有報(bào)道，DNA能夠制備成直徑達(dá)10nm的納米通道。所有已有的DNA納米孔均采用DNA雙鏈平行排列的形式插入膜中。

在該文獻(xiàn)中，深入詳細(xì)的闡述了DNA分子如何突破當(dāng)前的技術(shù)限制，增加了納米孔的尺寸及增加了孔形狀的多樣性。在最初的DNA納米孔設(shè)計(jì)中，我們受限于所有DNA雙鏈需以直角的方式插入膜中的要求。為了克服這種限制，我們利用DNA搭建的方式，將DNA雙鏈成束搭建成納米孔模塊，插入膜中，并組裝成完整的納米孔，請(qǐng)見(jiàn)Fig. 1a-c。模塊化的應(yīng)用能夠提高大小和形狀上的靈活性，比如可以構(gòu)建成三角形，方形，五邊形和六邊形。請(qǐng)見(jiàn)Fig. 1d。結(jié)合可調(diào)控的邊長(zhǎng)（10和20nm)的亞單位，構(gòu)建的納米孔腔面積可從43nm²到400nm²，請(qǐng)見(jiàn)Fig. 1d。相比于傳統(tǒng)的蛋白構(gòu)成的納米孔，大小提高了260倍。

可調(diào)控大小和形狀的DNA膜納米孔示意圖

我們?cè)O(shè)計(jì)的納米孔，帶有一個(gè)額外的帽結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)決定了整個(gè)孔的形狀，即帽下插入膜中的桶狀結(jié)構(gòu)。同時(shí)，該結(jié)構(gòu)還具有以下特性：該帽狀結(jié)構(gòu)可通過(guò)雙鏈亞單位的數(shù)量，調(diào)節(jié)其高度和寬度；該帽狀結(jié)構(gòu)內(nèi)部，可通過(guò)短的單鏈或雙鏈DNA進(jìn)行連接；此外，穩(wěn)定的內(nèi)部DNA雙鏈可以防止帽的不穩(wěn)定及形狀的變化；在自我穩(wěn)定的三角形中，內(nèi)部可以不需要DNA雙鏈連接；確定的帽的幾何形狀定性了孔的跨膜形狀。在我們目前的設(shè)計(jì)中，膜孔壁由一個(gè)雙鏈厚度組成，但更厚的孔壁是完全可以實(shí)現(xiàn)的。在膽固醇脂質(zhì)的作用下，桶狀結(jié)構(gòu)插入膜中。該孔狀的設(shè)計(jì)不僅使得該孔插入到脂質(zhì)雙分子層中，并且可以插入到MinlON flow細(xì)胞膜中，以用于免疫學(xué)相關(guān)的蛋白檢測(cè)。

我們首先設(shè)計(jì)一系列六邊形帽，不帶有穿膜的桶狀結(jié)構(gòu)，用以檢驗(yàn)?zāi)た椎脑O(shè)計(jì)。包括10nm亞單位構(gòu)成的三角形-10nm帽，方形-10nm帽，五邊形-10nm帽，六邊形-10nm帽；20nm亞單位構(gòu)成的三角形-20nm帽和方形-20nm帽。請(qǐng)見(jiàn)Fig. 1d和2a。組裝路徑包括混合DNA骨架的程序性折疊和DNA寡核苷酸鏈退火形成特定的納米結(jié)構(gòu)。經(jīng)此產(chǎn)生的自組裝DNA帽成分均一，可經(jīng)DNA凝膠電泳進(jìn)行驗(yàn)證是否為均一的單條帶。請(qǐng)見(jiàn)Fig. 2a。

帽結(jié)構(gòu)可經(jīng)凝膠電泳并純化后，由負(fù)染以及電鏡進(jìn)一步確定其結(jié)構(gòu)。與設(shè)計(jì)的方案一致，帽的結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)預(yù)期的多邊形形狀以及亞單位長(zhǎng)度，如長(zhǎng)度分別是9.62 ± 0.69 nm, 9.86 ± 0.37 nm 和20.17 ± 1.74 nm的三角形-10nm帽，方形-10nm帽和方形-20nm帽。

DNA納米孔帽結(jié)構(gòu)及孔結(jié)構(gòu)的組裝和性質(zhì)鑒定

在確定帽設(shè)計(jì)的可行性后，我們測(cè)試了帶有桶狀的穿膜的納米孔通道是否可以在形狀和大小上進(jìn)行調(diào)節(jié)。我們測(cè)試了三角形-10nm, 方形-10nm和方形-20nm。請(qǐng)見(jiàn)Fig. 2b。對(duì)于該結(jié)構(gòu)和膜的相互作用方面，在5x2的雙鏈DNA帽下方攜帶了幾個(gè)固醇類生物標(biāo)簽，每個(gè)10nm亞單位連接10個(gè)標(biāo)簽，每個(gè)20nm亞單位連接15個(gè)標(biāo)簽。第一步，首先組裝不帶有標(biāo)簽的孔狀結(jié)構(gòu)，自裝后產(chǎn)生與預(yù)期一致的單條帶的DNA以及與預(yù)期一致的電鏡結(jié)構(gòu)。第二步，膜孔上連接固醇類標(biāo)簽。可通過(guò)凝膠電泳條帶大小判斷標(biāo)簽連接的結(jié)果。請(qǐng)見(jiàn)Fig. 2c。

為了驗(yàn)證固醇類標(biāo)簽?zāi)軌虼龠M(jìn)納米孔和脂質(zhì)膜的結(jié)合，通過(guò)電鏡直接對(duì)標(biāo)有固醇的方形-20nm的納米孔在小的膜泡上的形狀進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析。并用Atto647N-標(biāo)記的方形-20nm納米孔和膜的脂質(zhì)POPC的熒光共定位進(jìn)一步確認(rèn)其與膜的結(jié)合。請(qǐng)見(jiàn)Fig. 2e。

可通過(guò)單通道電流檢測(cè)的方法，確認(rèn)DNA納米孔以確定的，可調(diào)控的通道腔的方式插入脂雙分子層。當(dāng)電壓施加于膜上時(shí)，該技術(shù)可記錄通過(guò)通道的電子流。我們分析了三角形-10nm納米孔，方形-10nm納米孔和方形-20nm孔的電子流，其電導(dǎo)率隨著納米孔的大小增加而增加。請(qǐng)見(jiàn)Fig. 3a, b, c. 在1 M KCl, 10 mM HEPES, pH 7.4和+50 mV的跨膜電勢(shì)的標(biāo)準(zhǔn)條件下，納米孔的電流未出現(xiàn)變化。此外，更大的納米孔產(chǎn)生了更高的電導(dǎo)率，平均變化如下：2.10 ± 0.21 nS (n = 19), 4.58 ± 0.27 nS (n = 29) 和8.91 ± 0.33 nS (n = 17; Fig. 3a(iv),b(iv),c(iv))。三角形-10nm的納米孔與方形-10nm的納米孔之間電導(dǎo)率的檢測(cè)值差異是2.2倍，和理論預(yù)期的1.8倍差異幾乎一致。方形-10nm和方形-20nm納米孔之間的電導(dǎo)率檢測(cè)值差異是1.9倍，比預(yù)期值2.8倍低。可能是因?yàn)閬?lái)自側(cè)面膜的壓力可能影響了插入其中的通道的大小，可通過(guò)增加通道的穩(wěn)定性而減少這種差異。

多邊形DNA納米孔的電導(dǎo)性能檢測(cè)

我們進(jìn)一步測(cè)試了DNA納米孔在單分子水平上對(duì)無(wú)標(biāo)記的，特異性的IgG抗體進(jìn)行檢測(cè)的能力。我們選擇方形-10nm的納米孔，以適配10nm大小的IgG分子。納米孔連接有生物素標(biāo)簽，用于特異性結(jié)合抗生物素抗體。斑點(diǎn)印跡法確認(rèn)了抗體與生物素標(biāo)簽的特異性結(jié)合。在單通道電流記錄檢測(cè)中，標(biāo)簽并未對(duì)電導(dǎo)特性產(chǎn)生影響，請(qǐng)見(jiàn)Fig. 4b，然而抗體的添加導(dǎo)致了電流的阻塞，說(shuō)明存在單個(gè)結(jié)合事件的發(fā)生，請(qǐng)見(jiàn)Fig. 4b。而此單個(gè)事件發(fā)生的頻率和抗體濃度具有良好的線性相關(guān)性，可以通過(guò)抗體濃度和1/τon的線性關(guān)系進(jìn)行說(shuō)明，τon代表的是事件發(fā)生的間隔時(shí)間，請(qǐng)見(jiàn)Fig. 4b。同時(shí)，我們由非生物素化的方形-10nm的對(duì)照納米孔以及非特異性抗體對(duì)照組可知，上述結(jié)合是特異性的。同樣，非同源性BSA做為底物時(shí)，生物素化的方形-10nm納米孔未出現(xiàn)電流阻塞效應(yīng)。

抗體結(jié)合的單分子動(dòng)力學(xué)效應(yīng)可通過(guò)納米孔的電流相對(duì)幅度A/I o變化，請(qǐng)見(jiàn)Fig. 4b以及持續(xù)時(shí)間，τ off 變化進(jìn)行檢測(cè)，請(qǐng)見(jiàn)Fig. 4b。并對(duì)它們之間相對(duì)關(guān)系進(jìn)行分析，請(qǐng)見(jiàn)Fig. 4d。超過(guò)95%的結(jié)合事件的電流幅度在48.2 ± 7.7% (±s.d., n = 205; Fig. 4d) 。平均的持續(xù)時(shí)間τoff在0.66 ± 0.02 s。參數(shù)τoff 和 τon 分別代表動(dòng)力學(xué)解離和結(jié)合常數(shù)Koff和Kon，請(qǐng)見(jiàn)Fig. 4c。抗體的解離常數(shù)和結(jié)合常數(shù)分別是1.79 ± 0.05 s ?1 和1.89 ± 0.38 × 10 9 M ?1 s?1。經(jīng)由該納米孔測(cè)量得到的參數(shù)稍高于經(jīng)由switchSENSE技術(shù)測(cè)量值0.056 ± 0.001 s?1 和1.73 ± 0.05 × 10 8 M ?1 s ?1 。

單分子平衡解離常數(shù)Kd=Koff/Kon, 在該納米孔體系下測(cè)量值為9.45 ± 1.92 × 10 ?10 M (±s.e.m.)，接近于switchSENSE技術(shù)測(cè)量值3.25 ± 0.11 × 10 ?10 M。說(shuō)明了經(jīng)由納米孔進(jìn)行分子結(jié)合分析的合理性。依賴于電壓的電信號(hào)記錄說(shuō)明蛋白通過(guò)電泳的方式通過(guò)納米孔，而非通過(guò)電滲透。僅正電勢(shì)可以導(dǎo)致抗體結(jié)合的電流阻塞和產(chǎn)生由抗體運(yùn)動(dòng)引起的更高的能量譜也可以證明這一點(diǎn)，請(qǐng)見(jiàn)Fig. 4e和Fig. 4f。BSA通過(guò)非生物素化的DNA納米孔的過(guò)程中，也可以檢測(cè)到該電泳現(xiàn)象。

最后，我們?cè)u(píng)估了DNA納米孔是否可以插入MinION flow 細(xì)胞中，并靈敏的感應(yīng)人SARS-CoV-2抗體。為了更好的與Y型結(jié)構(gòu)的抗體適配，可以選擇三角形-20nm的膜納米孔。請(qǐng)見(jiàn)Fig. 4g。

DNA納米孔對(duì)特異性無(wú)標(biāo)記IgG分子的檢測(cè)作用

當(dāng)抗體的受體沒(méi)有與納米孔連接時(shí)，三角形-20nm納米孔能夠產(chǎn)生穩(wěn)定的單通道電流，其平均電導(dǎo)率為7.83 ± 0.71 nS (±s.e.m., n = 9)，高出對(duì)照的方形-10nm納米孔1.7倍，與預(yù)期的電導(dǎo)率差異一致。三角形-20nm的納米孔與SARS-CoV-2 刺突蛋白連接后，成為特異性識(shí)別SARS-CoV-2抗體的納米感受器。請(qǐng)見(jiàn)Fig. 4g。刺突蛋白與納米孔腔的結(jié)合是通過(guò)不可逆轉(zhuǎn)的金屬螯合作用，將分子連接到寡聚核苷酸上。帶有刺突蛋白的DNA納米孔，可以產(chǎn)生穩(wěn)定的電流輸出，平均電導(dǎo)率為1.8 ± 0.2 nS (±s.e.m., n = 23) ，低于未連接刺突蛋白的三角形-20nm納米孔的電導(dǎo)率。

當(dāng)加入人的 SARS-CoV-2 抗體后，能夠產(chǎn)生納米孔的電流阻塞效應(yīng)，請(qǐng)見(jiàn)Fig. 4h，說(shuō)明抗體與孔內(nèi)受體發(fā)生結(jié)合效應(yīng)。結(jié)合效應(yīng)產(chǎn)生的相對(duì)電信號(hào)幅值為61.7 ± 6.9% (±STD, n = 357) ，平均結(jié)合時(shí)間為1.7 ± 8.6 s (±STD, n = 357; Fig. 4i)。該數(shù)據(jù)表明，三角形的納米孔形狀能夠?qū)е赂叩碾娏髯枞?

膜納米孔在科學(xué)研究中已經(jīng)顯示出重要的價(jià)值，我們的研究集中于開(kāi)發(fā)在大小和形狀上能夠更加靈活調(diào)控的納米孔。該研究依賴于DNA納米技術(shù)得以實(shí)現(xiàn)。通過(guò)目前的常見(jiàn)檢測(cè)設(shè)備，我們通過(guò)單分子蛋白通過(guò)納米孔時(shí)的參數(shù)證實(shí)了該膜納米孔的應(yīng)用價(jià)值。對(duì)于傳統(tǒng)的以蛋白質(zhì)為材料構(gòu)建的納米孔，由于孔徑的限制，無(wú)法對(duì)10nm大小的底物進(jìn)行檢測(cè)。而分子直接進(jìn)入納米腔中，能夠最大的獲取單分子的生物物理性質(zhì)，酶活性或相互作用特性等方面的信息。根據(jù)底物的大小對(duì)納米孔進(jìn)行定制，可以實(shí)現(xiàn)納米孔和底物的最佳匹配。更大的納米孔可以用于不規(guī)則的幾何構(gòu)建，匹配非對(duì)稱性的底物分子。總體上看，該人工合成的納米孔，突破了在天然狀態(tài)下的膜孔無(wú)法實(shí)現(xiàn)的功能，幫助轉(zhuǎn)運(yùn)并快速方便的檢測(cè)與其相互作用的蛋白分子，顯示出重要的市場(chǎng)應(yīng)用價(jià)值。