質量光度法（MP）可量化溶液中生物大分子的質量分布。它在分析生物樣本的純度、完整性和原始條件下的功能方面的用途已經被證明，在本應用說明中，將證明質量光度法在變性條件下，是研究低聚蛋白質變性和再變性的有用工具。

為了舉例說明質量光度法在解除/重折疊實驗中的優勢和局限性，我們進行了一個關于烯醇化酶的案例研究。質量光度法是一種超靈敏的單分子質量分析技術，可檢測溶液中的蛋白質（或其他生物分子）在玻璃-水界面上的散射信號。與玻片結合粒子的散射光量取決于粒子的質量而非形狀，所以無論蛋白質是折疊還是展開，因其質量不會改變，質量光度讀數也不會改變。

烯醇酶在原生和變性條件下的MP測量結果表明，MP對蛋白質的折疊狀態并不敏感。在原生條件下，烯醇酶主要形成90 kDa質量的同源二聚體和一些45 kDa質量的單體。在變性條件（尿素）下，二聚體分離成未折疊的單體，但同預期一樣，用MP測量的未折疊單體的質量（45 kDa）與折疊單體的質量相同（下圖）。MP對折疊狀態不敏感，因此是監測折疊依賴性低聚物的一種可行方法。

蛋白質解折疊實驗通常是在變性劑濃度非常高的情況下進行的。然而，尿素和GdnHCl 在水溶液中濃度較高時，會形成氫鍵團簇，因為團簇的光學性質與周圍溶液的光學性質不同，這種團簇可以用MP觀察到。這種差異會導致背景光散射，在MP圖像中顯現，隨著尿素濃度的增加，圖案及其相應的信號也隨之增加，直到尿素濃度超過1 M時達到一個峰值（下圖）。

來自團簇的圖案信號代表背景噪聲，會增加使用MP測量生物大分子質量的難度，甚至可能無法量化散射信號。因此，在使用變性劑時，檢查背景信號非常重要，這將為實驗設定噪聲基線。當變性劑被稀釋時，MP可以為變性過程提供更可信的信息，從便監測低聚蛋白質的重折疊動態。變性烯醇酶樣品經PBS稀釋恢復到接近原生狀態后，MP敏感捕捉到了這一轉變（下圖），這得益于MP檢測的的快速性及其在寬濃度范圍內的準確性。實驗中還利用MP技術監測了變性烯醇酶樣品的重折疊動態，發現二聚體在稀釋后的 60分鐘內逐漸重新形成（下圖）。

二聚體的恢復動態可通過繪制單體/二聚體比率與時間的函數關系圖來觀察。恢復速度取決于所使用的變性物質，可以看出，用GdnHCI變性的烯醇酶恢復得更快（下圖）。

綜上所述，質量光度法能夠提供有關生物大分子和復合物的質量和組成的準確信息，是一種監測多聚復合物中蛋白質變性和再變性過程的簡單方法，并且能夠輕松比較變性劑的效果。

Refeyn Two ^MP與 Refeyn Samux^MP是基于質量光度法（MP）技術的臺式單分子質量分析系統，其機身緊湊，安裝簡便。僅需消耗幾微升樣品和潔凈的玻片，就能直接測量溶液中單個分子的質量，并且無需任何標記，為生物分子檢測創造了無限可能。

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